白花蛇舌草化学成分及其抗结肠癌活性初探*

张其爱，杨佳彬，林冠丽，李志健，曾彩芳△

（1. 广州医科大学，广东 广州 511436； 2. 广州医科大学附属第二医院，广东 广州 511447）

白花蛇舌草为茜草科耳草属植物白花蛇舌草Hedyotis diffusa（Willd.）Roxb. 的全草，能清热解毒、利湿通淋，有抗肿瘤作用［1-3］，而国内临床常用于治疗中晚期原发性肝癌［4］。结肠癌的发病率和死亡率在我国均逐年上升，严重威胁人民健康。根治性肿瘤切除术为临床常用治疗方式［5］，但患者术后的5 年生存率仅50%～60%，且对于术后复发及不能手术患者，多药耐药性（MDR）为结肠癌化学药物治疗（简称化疗）失败的重要原因［6-7］。白花蛇舌草抗肿瘤机制为增强宿主非特异性免疫，以抑制耐药型结肠癌细胞的生长并促进凋亡［8-9］，而目前尚无有关其化学成分和药理作用研究的报道。为探究其抗耐药型结肠癌药效物质基础，前期对白花蛇舌草化学成分进行了研究，初步筛选出其抗结肠癌的有效部位为乙酸乙酯部位，本研究中进一步对该有效部位的化学成分进行探讨。现报道如下。

1 仪器、试药与细胞

1.1 仪器

CP225D 型电子天平（德国Sartorius 公司）；Bruker AV-400/500 FT 型傅立叶变换超导核磁共振谱仪（德国Bruker 公司）；Q-TOF micro 型四极杆飞行时间高分辨质谱仪（美国Waters 公司）；WRX - 4 型熔点测定仪（上海星尧科学仪器有限公司）；RV - 8 型旋转蒸发仪（德国IKA 公司）；Pure C-815型中压制备色谱仪（瑞士Buchi 公司）；Agilent 1260 Infinity Ⅱ制备型高效液相色谱系统（美国Agilent 公司）；311 型细胞培养箱（美国Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2 试药

100～200 目液相色谱柱用硅胶（烟台黄海化工有限公司，批号为0210056）；二甲基亚砜（DMSO）、MTT 试剂（美国Aladdin公司，批号分别为D201041，A191008）；RPMI 1640 培养基、DMEM 培养液、胎牛血清、胰蛋白酶（美国Gibco 公司，批号分别为8120485，BC20200311，2020490C，PYM2020011）；5-氟尿嘧啶（5-FU，天津金耀有限公司，批号为201607）；有机试剂均为分析纯，水为屈臣氏蒸馏水。白花蛇舌草药材饮片（广州致信中药饮片有限公司，批号为20200123），产地为广西壮族自治区玉林市，由南方医科大学中药鉴定教研室张宏伟教授鉴定为正品。

1.3 细胞

人结肠癌HT-29 和SW480 细胞株（中国科学院上海生科院细胞资源中心）。

2 方法与结果

2.1 化学成分的提取与分离

取药材饮片样品30 kg，精密称定，用95%乙醇（样品质量的6 倍）加热回流提取3 次，每次2 h，合并提取液，60 ℃下减压浓缩至无醇味，加水稀释制得混悬液（4～5 L），依次用石油醚、乙酸乙酯、饱和正丁醇萃取，以混悬液-溶剂（1∶1，V/V）反复萃取至萃取溶剂色淡，合并各萃取液，并减压浓缩；取乙酸乙酯部位上中压制备色谱，以乙酸乙酯和石油醚梯度洗脱［0，10%，20%，40%，60%，80%，100%（乙酸乙酯/石油醚）］，得7 个部位；取40%乙酸乙酯部位经硅胶柱层析，以石油醚和乙酸乙酯进行梯度洗脱［0，20%，40%，60%，100%（乙酸乙酯/石油醚）］，洗脱液经薄层色谱（TLC）分析、合并，并经制备型高效液相色谱纯化，得9个化合物。

2.2 结构鉴定

化合物1：浅绿色固体；香草醛- 浓硫酸试剂显紫色；mp. 130～131 ℃；ESI - MS：m/z439.8［M - H］-。1H - NMR（400 MHz，CDCl3）δ：5.21（1H，t，J= 3.5 Hz，H-12），2.75（1H，dd，J=13.7，4.2 Hz，H-18），1.15，1.09，1.05，1.03，0.93，0.91，0.81（CH3× 7，s，H - 23，24，25，26，27，29，30）。13C - NMR（CDCl3，100 MHz）δ：184.0（C-28），143.6（C-13），122.4（C-12），56.2（C-3），55.3（C-5），47.4（C-17），46.9（C-19），46.6（C-14），45.8（C-8），41.7（C-9），41.0（C-18），39.3（C-4），39.1（C-10），36.8（C-1），34.1（C-22），33.8（C-21），33.0（C-29），32.4（C-7），32.1（C-23），30.7（C-20），27.7（C-15），26.4（C-2），25.8（C-27），23.5（C-30），23.5（C - 16），22.9（C - 11），21.4（C - 26），19.5（C-6），17.0（C-25），15.0（C-24）。以上数据与文献［10］的报道一致，故鉴定化合物1为齐墩果酸。

化合物2：白色固体；香草醛-浓硫酸试剂显紫色；mp. 254～255 ℃。1H - NMR（CDCl3，400 MHz）δ：4.67（1H，s，H-29a），4.55（1H，s，H-29b），1.63（1H，s，H-30），1.00，0.92，0.91，0.86，0.82（H × 5，s，H - 23，24，25，26，27）。13C - NMR（CDCl3，400 MHz）δ：181.0（C -28），149.4（C-20），108.7（C-29），58.2（C-3），56.3（C - 5），53.9（C - 17），48.8（C - 19），48.1（C - 14），46.3（C - 8），45.8（C - 9），41.47（C - 4），39.61（C -18），38.3（C-15），37.4（C-10），36.0（C-1），35.8（C-2），33.1（C-13），32.5（C-7），31.1（C-16），29.5（C-21），28.6（C-15），25.6（C-22），24.5（C-2），20.3（C-24），20.0（C-28），18.5（C-27），18.3（C-6），14.9（C-23），14.8（C-26），13.6（C-25）。以上数据与文献［11］的报道一致，故鉴定化合物2为白桦脂酸。

化合物3：淡黄色粉末；香草醛- 浓硫酸试剂显紫色；mp. 285～286 ℃；ESI - MS：m/z469.1［M - H］-。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δ：5.5（1H，s，H-12），1.41，1.39，1.34，1.26，1.10，1.07，0.77（3H×7，s，23，24，25，26，27，28，29）。13C-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δ：199.01（C-12），180.9（C-30），169.0（C-13），127.3（C - 12），86.6（C - 4），60.0（C - 17），56.3（C - 5），55.1（C - 3），52.4（C - 19），50.2（C - 14），45.5（C -8），43.5（C-9），42.0（C-18），40.1（C-10），38.7（C-1），33.8（C - 22），33.6（C - 21），33.2（C - 29），32.3（C -7），31.9（C-23），31.0（C-20），30.8（C-15），29.7（C-2），29.0（C - 27），27.5（C - 30），27.0（C - 11），23.5（C - 16），23.0（C - 11），21.3（C - 26），20.6（C - 6），19.7（C-25），18.2（C-24）。以上数据与文献［11］的报道一致，故鉴定化合物3为熊果酸。

化合物4：浅黄色粉末；香草醛- 浓硫酸试剂显天蓝色；mp. 305～306 ℃。1H - NMR（CDCl3，400 MHz）δ：8.05（2H，d，J=8.8 Hz，H-2′，6′），6.39（2H，d，J=8.8 Hz，H-3′，5′），6.44（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），6.19（1H，d，J=2.0 Hz，H-6）。13C-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δ：176.4（C - 4），164.4（C - 7），161.2（C - 9），159.7（C - 4′），156.7（C - 5），147.3（C - 2），136.1（C - 3），130.0（C -2′6′），122.1（C-1′），115.9（C-3′5′），103.5（C-10），98.7（C-6），94.0（C-8）。以上数据与文献［12］的报道一致，故鉴定化合物4为山柰酚。

化合物5：黄色针状结晶；香草醛- 浓硫酸试剂显天蓝色；mp.301～302 ℃。1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：12.5（1H，s，OH-5），10.8（1H，s，OH-3），9.57（1H，s，OH-3′），9.3（2H，s，OH-7，4′），7.66（1H，d，J=2.0 Hz，H - 2′），7.53（1H，d，J= 2.0 Hz，H - 6′），6.82（1H，d，J= 8.0 Hz，H - 5′），6.39（1H，d，J= 2.0 Hz，H - 8），6.17（1H，d，J=2.0 Hz，H-6）。13C-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δ：175.4（C - 4），163.4（C - 7），160.2（C -9），159.7（C-4′），156.7（C-4′），156.1（C-5），146.8（C - 2），135.1（C - 3），119.0（C - 2′6′），122.1（C -1′），115.6（C - 3′5′），103.2（C - 10），98.2（C - 6），93.0（C-8）。以上数据与文献［12］的报道一致，故鉴定化合物5为槲皮素。

化合物6：红色针晶；溶于甲醇；Borntrager′s 反应和乙酸镁反应为阳性；香草醛- 浓硫酸试剂显黄色；mp. 255～256 ℃。1H - NMR（CD3OD，400 Hz）δ：12.21（1H，s，OH - 1），12.10（1H，s，OH - 8），10.15（1H，s，OH - 3），7.61（1H，m，H - 4），7.28（1H，d，J= 2.2 Hz，H - 5），7.08（1H，d，J= 6.7 Hz，H - 2），6.68（1H，m，H - 7），2.46（3H，s，CH3）。13C - NMR（CD3OD，400 Hz）δ：164.3（C-1），107.2（C-2），164.9（C-3），106.5（C-4），120.5（C - 5），149.8（C - 6），124.7（C - 7），161.9（C-8），193.1（C-9），133.5（C-11），113.2（C-12），103.9（C - 12），108.7（C - 13），135.6（C - 14），21.3（- CH3）。以上数据与文献［13］的报道一致，故鉴定化合物6为大黄素。

化合物7：淡黄色粉末；溶于吡啶；Borntrager′s 反应和乙酸镁反应为阳性；香草醛- 浓硫酸试剂显黄色；mp. 321～322 ℃。1H - NMR（DMSO -d6，400 Hz）δ：11.91（2H，s，OH - 1，8），8.12（1H，s，OH - 8），7.82（1H，s，OH - 3），7.75（1H，m，H - 4），7.73（1H，d，J=2.1 Hz，H - 5），7.40（1H，d，J= 7.8 Hz，H - 2）。13C -NMR（DMSO-d6，400 Hz）δ：164.3（C-1），124.2（C-2），138.9（C - 3），119.5（C - 4），118.5（C - 5），137.8（C -6），124.7（C - 7），161.9（C - 8），193.1（C - 9），181.7（C - 10），133.2（C - 4a），118.9（C - 8a），118.7（C -1a），135.6（C - 5a），163.5（- COOHC）。以上数据与文献［13］的报道一致，故鉴定化合物7为大黄酸。

化合物8：淡黄色粉末；mp. 240～2 412 ℃；ESI -MS：m/z268［M - H］-。1H - NMR（CDCl3，400 Hz）δ：8.15（1H，d，J=8.0 Hz，H-8），7.43（1H，d，J=8.0 Hz，H-7），8.06（1H，s，H-5），7.76（1H，s，H-4），7.73（1H，s，H-1），4.02（3H，s，- OCH3），2.48（3H，s，- CH3）。13C -NMR（CDCl3，400 Hz）δ：186.7（C - 10），181.3（C - 9），153.1（C-2），1149.3（C-3），143.7（C-6），131.7（C-7），134.5（C - 5a），130.6（C - 10a），121.7（C - 8），119.3（C - 5），117.4（C - 10a），113.3（C - 9a），110.7（C- 4），103.4（C- 1），54.1（-OCH3），23.3（-CH3）。以上数据与文献［13］的报道一致，故鉴定化合物8为芦荟大黄素。

化合物9：淡黄色粉末；溶于吡啶；Borntrager′s 反应和乙酸镁反应为阳性；mp.196～197 ℃。1H-NMR（CDCl3，400 Hz）δ：11.91（2H，s，OH-1，8），8.12（1H，s，OH- 8），7.82（1H，s，OH-3），7.75（1H，m，H-4），7.73（1H，d，J= 2.1 Hz，H - 5），7.40（1H，d，J= 7.4 Hz，H - 2），2.46（3H，s，CH3）。13C - NMR（DMSO -d6，400 Hz）δ：164.3（C - 1），124.2（C - 2），138.9（C - 3），119.5（C -4），118.5（C - 5），137.8（C - 6），124.7（C - 7），161.9（C-8），193.1（C-9），181.7（C-10），133.2（C-4a），118.9（C - 8a），118.7（C - 1a），135.6（C - 5a），23.5（- CH3）。以上数据与文献［13］的报道一致，故鉴定化合物9为大黄酚。

2.3 体外抗结肠癌活性筛选

采用MTT法检测化合物1-9对SW480和HT-29细胞生长的抑制作用［14］。取9个化合物及5-FU适量，分别以DMSO 溶解，并配成浓度为200 mmol/ L 的母液，加DMEM 培养液稀释，分别配成浓度为200.0，100.0，50.0，25.0，12.5，6.3 μmol/L 的含药培养液。取SW480和HT - 29 细胞，加入含10% 胎牛血清的1640 培养液（含双抗），在37 ℃、5% CO2培养箱中培养至对数生长期。取细胞适量，调细胞密度为5 × 103个/ 孔，接种于96孔板（每孔100 μL），以上述含药培养液继续培养24 h，培养3 d 后，弃去上清液，每孔加入5 g/ L MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h，弃去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min，以酶标仪测定570 nm 波长处各孔的吸光度（OD）值，并计算半数抑制浓度（IC50）。实验另设DMSO对照（等体积含1‰DMSO 的完全培养基）及空白对照（等体积不含细胞的完全培养基）；均设6 个复孔。结果见表1。

表1 9个化合物的IC50（μmol/L，n=6）Tab.1 IC50 of nine compounds（μmol/L，n=6）

结果表明，化合物1 在高浓度（≥100.4 μmol/ L）时表现出一定的肿瘤细胞抑制活性，但与5-FU相比不显著（P＞0.05）；化合物2在中高浓度（≥26.5 μmol/L）时对SW480和HT-29细胞的生长具有显著抑制作用；而化合物3，4，5，6，7，8，9几乎未显示抑制肿瘤细胞的活性。

3 讨论

白花蛇舌草作为临床常用抗结肠癌中草药［15］，药理及药物化学研究相对丰富，中外学者从中分离并鉴定出上百个化合物，包括黄酮类、蒽醌类及环烯醚萜类［16］，但未见对分离得到的单体进行抗结肠癌活性筛选的报道。本研究中对白花蛇舌草有效部位进行分离、纯化，提取并鉴定出的化合物2，6，7，8（白桦脂酸、大黄素、大黄酸、芦荟大黄素）为从该植物中首次分离得到，经初步考察发现，化合物齐墩果酸和白桦脂酸对SW480和HT-29 细胞的生长有一定抑制作用，尤其是白桦脂酸在中高浓度时对肿瘤细胞的生长有显著抑制作用。白桦脂酸为有抗癌前景的天然产物，其作用包括直接杀伤肿瘤细胞，激活肿瘤细胞经线粒体途径凋亡，增强机体的免疫功能以杀伤肿瘤细胞，以及作为抑癌增效剂，在联合化疗中避免MDR的产生，增强抗肿瘤药的治疗效果，但其抗结肠癌活性未见报道，本研究中初步揭示其抗结肠癌活性，其作用机制需深入研究［17-18］。本研究中初步探明了白花蛇舌草抗结肠癌的部分物质基础，可为其抗结肠癌的药理作用研究及后续开发提供参考。