METTL14介导的卵巢癌细胞促进肿瘤发生发展的分子机制初探

张玉英,黄成香,李 翠,刘洪云,闫 华

(临沂市中心医院,山东 临沂 276400)

据报道,甲基转移酶样14(METTL14)在多种癌症中的关键作用和分子机制方面取得了进展,尤其是在胃肠道癌症中,包括肝癌、结直肠癌、胃癌和胰腺癌等[1]。最近的研究表明,METTL14的失调与参与各种癌症恶性发展的表型密切相关,包括增殖、转移、凋亡、耐药性、肿瘤干细胞样特征、免疫治疗、慢性炎症和糖脂代谢等[2]。但METTL14在卵巢癌当中可能发挥的重要作用及其机制尚不清楚。本研究分析了癌症基因组图谱数据库(TCGA)中的卵巢癌数据,并进一步用实验证实了METTL14在不同临床病理特征卵巢癌组织中的表达。

1 材料和方法

1.1数据获取和处理 从XENA官网上下载卵巢癌的RNA-seq数据集和相应临床资料,删除信息不全的患者。用R软件(V3.6.3)的survival包分析了高低表达METTL14两组患者的总生存率(OS)和无疾病进展生存率(DFS),进一步分析了METTL14在不同临床病理特征中的表达情况,包括肿瘤分级、带瘤状态以及但双侧肿瘤。进一步利用METTL14在人群表达中位数,将患者分为高低表达METTL14两组,筛选TCGA数据库中两组中差异基因,筛选参数为|log2FC|>1,P<0.05。

1.2差异基因表达功能分析 利用R软件cluster Profiler包对上述差异表达基因进行GO功能富集分析和KEGG信号通路聚类分析,对预后基因进行功能注释,并探索METTL14在卵巢癌中可能参与的信号通路。

1.3人群信息及验证 纳入2022年1月—2022年6月就诊于本院并进行手术的卵巢癌患者,术后病理证实为卵巢上皮样癌,收集卵巢癌组织及癌旁组织,利用免疫组化、Western blot及qPCR等多种方法验证METTL14在二者当中的表达差异。进一步利用小干扰RNA(siRNA)转染卵巢癌细胞系TOV-21G,CCK8和Transwell方法观察干扰前后细胞系增殖及侵袭情况,证实METTL14在卵巢癌中发挥的作用。

1.4数据处理 使用SPSS 21.0和R软件进行统计学分析和相关图像的绘制。计量资料基因表达量为非正态分布数据,运用Wilcoxon 非参数秩和检验的方法对肿瘤组织和癌旁组织之间基因表达量的差异进行分析;计量资料患者年龄和生存时间符合正态分布表示为(均数±标准差)格式,采用独立样本t检验进行分析。计数资料差异性分析使用χ2检验。

2 结果

2.1METTL14与卵巢癌患者临床病理特征 高表达METTL14患者的OS和DFS均低于低表达患者(见封三图1A-B)。METTL14在高级别卵巢癌(G4)、带瘤生存以及双侧肿瘤患者中的表达量较高(见封三图1C-E)。

2.2METTL14相关差异基因及功能 通过对高低表达METTL14两组患者进行差异分析,共得到238个差异基因,差异基因火山图及热图见封三图2A-B所示。GO分析结果显示,差异基因主要富集在表皮发育、角质化、突触相关功能(见封三图2C);KEGG分析结果显示,差异基因主要在Hippo信号通路及mTOR信号通路中发挥作用(见封三图2D)。

2.3METTL14在卵巢癌患者当中表达量验证 免疫组化结果证实,METTL14在卵巢上皮样癌中表达显著高于正常卵巢组织(见封三图3A),qPCR及Western结果进一步证实,METTL14在mRNA及蛋白水平上,其卵巢癌组织中的表达量均升高(见封三图3B-C)。为了进行下一步METTL14相关功能实验,构建了敲减METTL14的卵巢癌细胞系TOV-21G,并对其敲减效率进行了验证,结果证实siRNA具有较高的敲减效率(见封三图3D-E)。

2.4METTL14与卵巢癌细胞系功能 CCK8实验证实卵巢癌细胞系在敲减METTL14后,抑制了细胞的增殖功能(见封三图4A),而Transwell实验证实,敲减METTL14后细胞的侵袭功能也发生了改变,METTL14降低了卵巢癌细胞的侵袭(见封三图4B)。

3 讨论

卵巢癌是女性最致命的肿瘤之一,很难在早期诊断。因此,迫切需要确定新的、有效的治疗方法。m6A作为RNA最丰富的转录后修饰,据报道与各种RNA的不同代谢过程有关[3]。METTL14是一种蛋白编码基因,作为主要的m6A甲基转移酶,调节m6A对mRNA和非编码RNA的修饰,与多种肿瘤预后的关系密切。在本研究中,笔者分析了TCGA数据库卵巢癌患者中METTL14与卵巢癌,发现METTL14高表达的患者预后较差,实验证实METTL14在卵巢上皮样癌患者中的表达量高于正常卵巢组织。有研究表明,利用m6A相关基因(包括METTL14)构建的肿瘤预后模型在高表达组的存活率远低于低风险组[4]。METTL14与原始B细胞、巨噬细胞M1和静息肥大细胞呈负相关,与巨噬细胞M0呈正相关,这些免疫细胞与癌症发展密切相关[5]。

本研究进一步分析了METTL14相关差异基因的功能和通路,结果证实,其富集于Hippo信号通路及mTOR信号通路。Hippo通路通过调控YAP表达,YAP靶向可能抑制MYPT1下调,促进卵巢癌细胞的侵袭和转移[6]。而MYPT1下调可以通过靶向Hippo通路,并增加卵巢癌干细胞性质,增加卵巢癌的肿瘤抵抗力[7]。mTOR信号通路通常参与到PI3K/AKT/mTOR通路中。通常情况下卵巢癌中mTOR通路发生异常,进而改变卵巢癌细胞在增殖、迁移、侵袭以及化疗抵抗中的重要作用。许多miRNA被发现影响P13K/AKT/mTOR通路,在肿瘤发生和卵巢癌行为中具有不同的潜在作用。特别是最近对其在化疗耐药方面的生物学功能进行了研究,从而确定了卵巢癌铂敏感性的潜在特异性间接生物标记物[8]。

本研究为探究卵巢癌发生发展的分子机制奠定了良好的基础,为m6A相关分子治疗和预后的预测提供了新的思路,同时也为临床医生的个体化治疗和精准化靶向治疗提供了有效的工具。