接种根瘤菌对甘草主要活性成分含量的影响及多元统计分析

丁晓霞， 马生军*， 陈文峰， 张澳港， 于宏超， 依里汗木江·加帕尔

（1.新疆农业大学食品科学与药学学院，乌鲁木齐 830052； 2.中国农业大学生物学院暨中国农业大学根瘤菌研究中心，北京 100193）

由于采挖破坏严重导致我国甘草野生资源匮乏，每年需进口大量甘草以满足市场需求[1]。因此，提高人工甘草药材质量、发展优质甘草栽培技术对于解决资源危机与实现甘草资源可持续利用具有重要意义。豆科植物-根瘤菌形成的共生体系不仅能够减少化学氮肥的施用，还能提高作物产量[2-3]、维持和恢复土壤肥力。

豆科作为种子植物第3大科在自然界中广泛分布，对豆科中药植物有效成分和产量的提升一直是广大研究者关注的焦点[4]。研究表明，在对豆科植物山豆根（Euchresta japonica）根瘤菌回接试验中发现，接种根瘤菌处理的山豆根幼苗中活性成 分有所 提 升[5]；田 菁（Sesbania cannabina(Retz.) Poir.）茎瘤固氮根瘤菌处理可提高穿心莲的活性成分含量[6]；根瘤菌可以提高豆科药用植物苦参（Sophora flavescensAlt.）中的苦参碱和氧化苦参碱含量[7]。因此，本研究欲分析根瘤菌对甘草中主要活性成分含量的影响，以期为进一步探究根瘤菌与甘草品质形成的机理提供技术支持，也为研究根瘤菌与豆科药用植物活性成分积累的关系提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验菌种由课题组前期分离获得[8-10]，分别为Rhizobium mongolense subsp.loessensestrainCCBAU 7190B、Agrobacterium tumefaciensIAM 13129 和Agrobacterium tumefaciensstrain CCBAU 65237，将其分别命名为70、77、78菌株。供试甘草包括乌拉尔甘草Glycyrrhiza uralensisFisch（.W）、光果甘草G. glabraL（.G）和胀果甘草G. inflataBat（.Z）。供试土为购买于乌鲁木齐市花卉市场的河沙。供试培养基为YMA培养基，配方为甘露醇10 g、酵母粉3 g、K2HPO40.25 g、KH2PO40.25 g、无水硫酸镁0.1 g、NaCl 0.1 g、琼脂粉18 g、去离子水1 000 mL，pH 6.8~7.2，灭菌30 min。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 将乌拉尔甘草、光果甘草、胀果甘草的种子分别用浓硫酸浸泡15 min，用蒸馏水冲洗干净；然后用75%酒精消毒10 min后播种在室外试验田生长。在生长1年后，选取长势一致的乌拉尔甘草、光果甘草、胀果甘草重新栽培于盆中，并将已活化培养的70、77、78根瘤菌菌液按照10 mL·株-1（675×10-6CFU·mL-1）浇灌接种于乌拉尔甘草（W）、光果甘草（G）、胀果甘草（Z）的地下部分。接种根瘤菌的甘草作为根瘤菌处理组，分别命名为T70、T77和T78，以未处理作为空白对照组（CK）。

1.2.2 测定方法 参照《中华人民共和国国药典》[11]方法从甘草干燥地下部分中提取甘草酸、甘草苷、甘草素、异甘草苷和异甘草素。采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定甘草酸、甘草苷、甘草素、异甘草苷和异甘草素的含量[12-13]，用乙腈溶解标准品，检测波长为254和370 nm，流动相分别为乙腈（A）和0.01%磷酸水（B），按表1进行梯度洗脱；流速为1.0 mL·min-1；进样体积为10 µL。

表1 流动相梯度条件Table 1 Timetable for gradient of eluate

1.3 数据处理和分析

采用 WPS Excel 2021、Origin 2021和 SPSS Statistics 23.0进行做图、t检验分析、相关性分析、聚类分析和主成分分析[14]。

2 结果与分析

2.1 方法学考察结果

HPLC结果（图1和2）表明，对照品溶液和待测样品溶液中甘草酸、甘草苷、甘草素、异甘草苷和异甘草素均得到充分分离，且处理组样品与对照品溶液中甘草苷、甘草酸、甘草素、异甘草苷和异甘草素的保留时间一致，保留时间均分别为11.234、28.698、23.242、19.316和31.322 min。

图1 对照品色谱图Fig. 1 Chromatograph of reference substance

图2 样品色谱图Fig. 2 Chromatograph of samples

2.1.1 线性关系 分别精密吸取已经制备好的甘草酸、甘草苷、甘草素、异甘草苷和异甘草素的对照品储备液1、5、10、15、20 µL，测定色谱峰的峰面积。以对照品的质量（µg）为横坐标（X），色谱峰峰面积（A）为纵坐标（Y）绘制标准曲线，如表2所示。5种活动成分线性回归方程的R2值均大于0.999。

表2 活性成分的线性关系Table 2 Linear relationship of active ingredients

2.1.2 稳定性 精密称取甘草药材粉末，按“1.2.2”方法操作，分别在0、2、4、8、12、24 h时进样，每次连续进样6次，计算得到5种活性成分的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.82%~2.71%，表明样品在24 h内稳定性良好（表3）。

表3 活性成分的稳定性Table 3 Stability test of active ingredients

2.1.3 精密性 取混合对照品溶液，按“1.2.2”项下色谱条件连续进样6次，计算得到5种活性成分的RSD为1.04%~2.65%，表明仪器精密性良好（表4）。

2.1.4 重复性 取甘草药材粉末，精密称定6份，分别按“1.2.2”方法操作，进样，计算得5种活性成分的RSD为1.03%~2.43%，表明试验方法重复性良好（表4）。

2.1.5 加样回收率 用加样回收法，取甘草药材粉末，精密称定5份，按“1.2.2”方法操作，分别加入适量的对照品，计算得到5种活性成分平均加样回收率为97.60%~100.74%，RSD为0.95%~2.86%（表4）。

表4 活性成分的精密度、重复性及加样回收率Table 4 Precision， repeatability and recovery of active ingredients

2.2 根瘤菌对甘草活性成分含量的影响

2.2.1 对甘草酸含量的影响 由图3可知，根瘤菌处理对甘草中的甘草酸含量影响显著。接种根瘤菌使乌拉尔甘草、光果甘草和胀果甘草中甘草酸含量较CK显著增加。对于乌拉尔甘草，3种菌株处理的甘草酸含量分别较CK增加122.26%、114.82%、307.76%，其中78菌株的效果显著优于70和77菌株。对于光果甘草，3种菌株处理的甘草酸含量分别较CK增加77.95%、46.58%、88.52%，其中70和78菌株的效果显著优于77菌株。对于胀果甘草，77和78菌株处理的甘草酸含量分别较CK增加114.64%、95.80%，其中77菌株的效果显著优于78菌株。

图3 不同根瘤菌处理下甘草的甘草酸含量Fig. 3 Glycyrrhizic acid content in rhizobia treated by different rhizobias

2.2.2 对甘草苷含量的影响 由图4可知，在接种根瘤菌后，乌拉尔甘草、光果甘草和胀果甘草的甘草苷含量均显著增加，除胀果甘草的70菌株处理外，其他处理均与CK差异显著。对于乌拉尔甘草，3种菌株处理的甘草苷含量分别较CK显著增加66.48%、10.64%、64.42%，其中70和78菌株的效果显著优于77菌株。对于光果甘草，3种菌株处理的甘草苷含量分别较CK显著增加61.85%、88.84%、97.26%，其中77和78菌株的效果显著优于70菌株。对于胀果甘草，77和78菌株处理的甘草苷含量分别较CK增加121.25%、50.86%，其中77菌株的效果显著优于78菌株。

图4 不同根瘤菌处理下甘草的甘草苷含量Fig. 4 Liquiritin content in licorice treated by different rhizobias

2.2.3 对甘草素含量的影响 3种根瘤菌处理使乌拉尔甘草、光果甘草和胀果甘草的甘草素含量较CK显著增加（图5）。对于乌拉尔甘草，3种菌株处理的甘草素含量较CK分别显著增加175.92%、162.26%、164.86%，3种根瘤菌处理间差异不显著。对于光果甘草，3种菌株处理的甘草素含量分别较CK增加406.34%、80.96%、505.85%，其中70和78菌株的效果显著优于77菌株。对于胀果甘草，3种菌株处理的甘草素含量分别较CK显著增加365.00%、394.85%、321.25%，3种根瘤菌表现为77＞70＞78。由此表明，根瘤菌处理有利于甘草中甘草素的积累。

图5 不同根瘤菌处理后甘草的甘草素含量Fig. 5 Liquiritigenin content in licorice treated by different rhizobias

2.2.4 对异甘草苷含量的影响 由图6可见，接种78菌株使乌拉尔甘草、光果甘草和胀果甘草中异甘草苷含量显著增加；70菌株处理可显著增加胀果甘草中异甘草苷含量，但对乌拉尔甘草、光果甘草影响不显著；77菌株处理使乌拉尔甘草和胀果甘草中异甘草苷含量显著增加，但对光果甘草影响不显著。对于乌拉尔甘草，77和78菌株处理的异甘草苷含量分别较CK显著增加15.44%和20.75%，其中78菌株的效果显著优于77菌株。对于光果甘草，仅78菌株处理的异甘草苷含量较CK显著增加42.15%。对于胀果甘草，70、77和78菌株处理的异甘草苷含量分别较CK显著增加19.50%、%和43.00%，其中78菌株的效果显著优于70和77菌株。

图6 不同根瘤菌处理后甘草的异甘草苷含量Fig. 6 Isoliquiritin content in licorice treated by different rhizobias

2.2.5 对异甘草素含量的影响 由图7可见，根瘤菌处理对3种甘草中异甘草素的积累有促进作用，接种根瘤菌后，乌拉尔甘草、光果甘草和胀果甘草中异甘草素含量均显著增加。对于乌拉尔甘草，3种菌株处理的异甘草素含量分别较CK显著增加46.75%、44.75%、160.93%，其中78菌株的效果显著优于70和77菌株。对于光果甘草，70、77和78菌株处理的异甘草素含量分别较CK显著增加40.79%、23.16%和50.04%，其中70和78菌株的效果显著优于77菌株。对于胀果甘草，3种菌株处理的异甘草素含量分别较CK显著增加37.35%、49.50%、27.38%，其中77菌株的效果显著优于70和78菌株。

图7 不同根瘤菌处理后甘草的异甘草素含量Fig. 7 Isoliquiritigenin content in licorice treated by different rhizobias

2.2.6 根瘤菌处理甘草中主要活性成分的多元统计分析 采用化学计量学软件Origan对不同处理甘草中主要活性成分含量进行聚类分析，结果（图8）表明，当组间距离为0.6时可划分为2类，W-CK、G-CK、Z-CK、W-T77、Z-T70、Z-T77、G-T70聚为一类，W-T70、G-T77、Z-T78、G-T78、W-T78聚为一类；当组间距离为0.4时可划分为4类，W-CK、G-CK、Z-CK 聚为一类，W-T77、Z-T70、Z-T77、G-T70 聚为一类，W-T70、G-T77、Z-T78、G-T78聚为一类，W-T78单独为一类。

图8 根瘤菌处理甘草中主要活性成分的聚类分析Fig. 8 Cluster analysis of main active components in rhizobium treated licorice

采用Origan软件进行相关性分析，结果（表5）表明，在处理组中，甘草苷与甘草素、异甘草素与甘草酸呈极显著正相关，相关系数分别为0.813、0.833；异甘草苷与异甘草素、甘草酸呈显著负相关，相关系数分别为0.694和0.693。

表5 根瘤菌处理甘草中主要活性成分的相关性分析Table 5 Correlation analysis of main active components in rhizobia treated licorice

主成分分析能够反映组内聚集和组间分离趋势[15]。采用Origan软件进行主成分分析，结果如图9所示。第1主成分（PC1）的贡献率为72.4%，第2主成分（PC2）的贡献率为15.6%，累计贡献率达88.0%，说明其能较全面地反映样品间的差异。由图9可知，甘草的12个处理组明显被划分为4类。

图9 根瘤菌处理甘草中主要活性成分的主成分分析Fig. 9 PCA of main active components in rhizobium treated licorice

3 讨论

根瘤菌与植物共生可促进次生代谢产物特别是萜类化合物的积累[16-17]。Xie等[18]发现，接种JX2、JX3菌株可明显提高山豆根（Radix SophoraeTonkinensis）苦参碱和氧化苦参碱含量。唐美琼等[5]研究发现根瘤菌在微量元素的协同作用下可促进黄芪（Astragalus membranaceus（Fisch.）Bunge.）生长，提高其毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量。因此，人们越来越重视利用根瘤菌来提高经济作物和中药材的产量和品质。

研究表明，接种根瘤菌配合适当的水分管理可提高甘草根中甘草酸和甘草苷的积累[19]。本研究表明，3种根瘤菌接种后能够在不同程度上提高3种甘草中的甘草酸和甘草苷含量，其中70、77、78菌株处理使乌拉尔甘草、光果甘草和胀果甘草中的甘草酸含量均较对照显著增加；在77、78菌株处理下，乌拉尔甘草和胀果甘草中的甘草苷含量分别较对照显著增加83.83%、97.26%和121.25%、50.86%，与Chen等[20]的研究结论相似。孟祥君等[21]发现岷山红三叶（Trifolium pratense）在不施氮条件下接种根瘤菌可提高其异黄酮类化合物含量。本研究也发现，接种3种根瘤菌可促进3种甘草中黄酮类物质的含量，即促进甘草素、异甘草苷、异甘草素含量的积累。综上所述，接种根瘤菌可显著提高3种甘草中的甘草酸、甘草苷、甘草素、异甘草苷、异甘草素含量。本试验将根瘤菌接种于1年生甘草苗根部，其接种过程条件较为严苛，且作用周期长，后续可针对不同生长时期的甘草进行接种研究，也可将菌种直接喷洒于甘草叶面研究其影响情况，以期达到提高甘草的产量与品质、缩短采收期的效果。本研究仅对干草的甘草酸、甘草苷、甘草素、异甘草苷和异甘草素含量进行了测定，并未对其他活性成分进行研究，后期可对甘草中酚类、香豆素类等物质展开研究。

本研究首次通过接种根瘤菌研究其对3种甘草中主要活性成分的影响，并采用多元统计分析方法，以接种不同根瘤菌对甘草中主要活性成分含量的影响筛选优质菌种，结果表明，3种根瘤菌均可促进3种甘草中甘草酸、甘草苷、甘草素、异甘草苷、异甘草素含量的积累，其中78菌株的效果较佳。因此，在研究和促进其他药用植物生长与有效成分合成时，可首先考虑通过根瘤菌改善，为提高甘草中活性物质含量提供了新途径。