低醇溶蛋白转基因大麦氮素转移特征

陈军， 李静雯*， 王立光， 朱天地， 陈琛， 包奇军， 欧巧明

（1.甘肃省农业科学院生物技术研究所，兰州 730070； 2.甘肃省农业科学院啤酒大麦研究所，兰州 730070）

大麦（barley）种植历史悠久，具有耐旱、耐瘠薄、抗逆性强、适应性广等特性[1]。大麦是啤酒生产的主要原料，需求量大，每年我国需从国外进口啤酒大麦200万t左右，占世界啤酒大麦用量的60%~70%[2]。籽粒蛋白含量是决定啤酒大麦商业品质的重要因素，一般的啤酒大麦品种蛋白含量均高于酿酒标准，如何降低大麦籽粒蛋白含量成为研究者关注的一个重要科学问题[3]。

目前，关于大麦籽粒蛋白含量的研究多集中于栽培措施的优化、氮高效利用新品种的培育、调控籽粒蛋白含量的基因克隆等方面。Mascher等[4]认为培育氮高效利用型大麦品种可降低大麦生产成本并提高大麦籽粒品质。研究表明，适量施氮可有效提高大麦籽粒的蛋白质含量[5-9]。随着研究的深入，不同作物中与氮素利用有关的基因陆续被克隆，小麦TaNRT2.1、水稻OsNRT1.1a、西红柿LeNRT2.3和大麦HvNRT2/3基因均与氮素转运相关[10]。但是，施氮栽培一般会导致大麦籽粒蛋白含量偏高。目前，氮高效利用品种较少，克隆的基因也无法应用于生产实践。醇溶蛋白作为大麦胚乳中主要的储藏蛋白，但不承担重要的生理功能，因此可以忍受较多的突变。研究表明，醇溶蛋白与麦芽品质及啤酒浑浊度、泡沫形成、高级醇及酯的形成等息息相关。Jonassen等[3]发现不同生长条件下的氮素营养会影响成熟籽粒中不同醇溶蛋白组分的比例。因此，通过基因工程手段降低大麦籽粒中醇溶蛋白含量成为解决该问题的突破点。

项目组前期采用RNAi成功抑制B-hordein合成，获得醇溶蛋白含量较对照显著降低的转基因大麦稳定株系[11]，而该材料的生长特性、产量、品质、氮素利用特性等一系列科学问题亟待解决。因此，本研究利用此稳定遗传的低醇溶蛋白转基因大麦为试验材料，以其受体为对照，探究氮肥施用量对其花后各营养器官氮素积累、分布及转运的影响，明确该低醇溶蛋白转基因大麦花后至籽粒形成过程中氮素的变化规律，为大麦氮素转运的生理机制及生产施肥实践奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试大麦为甘肃农业科学院生物技术研究所创制的以‘Golden Promise’（GP）[11]为受体获得的带有hpt基因的RNAi B-hordein转基因大麦纯系稳定株系（T），其醇溶蛋白含量较对照显著降低，总蛋白含量降低1%~2%；以其受体‘Golden Promise’作为对照（CK）。2019—2020年将2种材料在甘肃省农业科学院生物技术研究所转基因专用温室进行土培盆栽试验。供试土壤采自甘肃省农业科学院试验地，其基本理化性质为有机质16.65 g·kg-1，全 氮 1.1 g·kg-1，碱 解 氮 88.95 mg·kg-1，有 效 磷19.6 mg·kg-1，速效钾 206 mg·kg-1，pH 8.57。

1.2 试验设计

试验分别设置 0（本底氮，N0）、160（低氮，N160）、230（正常施氮，N230）和300 mg N·kg-1土（高氮，N300）4个供氮水平，每处理3次重复，采用完全随机排列。采用陶制花盆（有托盘）进行土培盆栽试验，每桶装土10 kg。供试肥料为尿素（N 46%）、磷酸二氢钾（P2O552%、K2O 34%）和硫酸钾（K2O 54%）。其中，氮肥分2次施入，70%作为基肥施用，30%在拔节期作为追肥施用；磷、钾肥均作基肥施用；其他管理按常规要求实施。

1.3 试验方法

分别于扬花期（flowering period，FP）、灌浆期（filling stage，FS）和成熟期（maturity period，MP）3个关键时期采集植株地上部样品，用蒸馏水润洗，吸水纸擦干，再按茎秆、叶、穗分开，分别装入信封袋内置于烘箱105 ℃杀青30 min，于80 ℃烘至恒重，粉碎备用。

测定各营养器官的干物质量；采用KDY9820型定氮仪测定全氮含量；采用近红外谷物分析仪（Foss Tecator，Infratec 1241，Grain Analyser v.3.40）测定籽粒蛋白含量；收获时测定株高、有效穗数、每穗粒数、千粒重和单株产量，每重复测定10株。

1.4 数据分析

采用Excel 2010整理数据并作图，采用SPSS 20.0进行相关分析（Pearson分析法）和差异显著性检验（Duncan法）。按照以下公式计算氮素积累量（nitrogen accumulation，NA）、氮素转运量（nitrogen transport，NT）、氮 素 转 运 率（nitrogen transfer rate，NTR）、氮 肥 生 产 效 率（nitrogen production efficiency，NGPE）、氮素转运量对穗的贡献 率（contribution rate of nitrogen transfer to ear，CRNTE）、氮 肥 农 学 效 率（nitrogen agronomic efficiency，NAE）、氮肥偏生产力（nitrogen partial productivity，NPP）、氮 肥 吸 收 利 用 率（nitrogen absorption and utilization rate，NAUR）等。

2 结果与分析

2.1 施氮量对转基因大麦产量构成及籽粒蛋白的影响

由表1可知，相同施氮量水平下，转基因大麦的单株籽粒产量高于对照；株高和千粒重较对照显著降低，有效穗数和每穗粒数较对照显著增加。由此表明，转基因大麦通过增加分蘖和有效穗数补偿产量配给，实现增产，说明其具有较强的籽粒产量形成能力，与前期研究结果一致[11]。

表1 不同处理下大麦的产量构成及籽粒产量Table 1 Yield composition and grain yield of barley in different treatments

由图1可知，同一施氮量水平，转基因大麦的地上部生物量显著高于对照，且在扬花期至灌浆期增幅较大，灌浆期至收获期增幅减缓，说明扬花期至灌浆期是大麦干物质积累的重要时期。各生育期转基因大麦的地上部生物量均显著高于对照，说明该转基因材料的氮素吸收利用效率高于对照。

图1 不同生育期地上部生物量Fig. 1 Aboveground biomass in different growth periods

大麦籽粒蛋白含量随施氮量增加而增加[12-13]。由图2可知，相同施氮量水平下，转基因大麦的籽粒蛋白含量显著低于对照，较对照降低0.58%~2.40%；随着施氮量增加，转基因大麦和对照的籽粒蛋白含量均有所增加，说明增施氮肥有利于提高大麦籽粒蛋白含量。

图2 籽粒蛋白含量Fig. 2 Grain protein content

2.2 施氮量对转基因大麦营养器官的氮素吸收、积累与转运的影响

2.2.1 不同生育时期转基因大麦植株的氮素含量 同一生育时期，大麦叶、茎秆的氮素含量随施氮量增加而提高，且施氮量影响氮素的转运效率[14]；而随生育进程推进，茎秆、叶中氮素含量逐渐降低，穗部氮素含量逐步升高[15]。由图3可知，随着施氮量的增加，对照穗中的氮素含量逐渐增加，而转基因材料穗中的氮素含量先增加后降低，在N160处理最高；对照叶中的氮素含量先增加后降低，在N230处理最高，而转基因材料在N300处理最高；对照茎秆中的氮素含量也先增加后降低，在N160处理最高，而转基因材料在N300处理最高。转基因大麦各营养器官的氮素含量分布表现为：穗＞叶片＞茎秆，且在扬花期穗中的氮素含量最高，说明充足的花前氮素积累主要集中在穗部，为后期灌浆结实奠定了物质基础。

图3 穗、叶和茎秆中氮素含量Fig. 3 Nitrogen contents of ear， leaf and stem

2.2.2 不同生育时期转基因大麦植株的氮素积累量及占比 氮素在植株体内的分配决定了氮素的再利用效率。由表2可知，同一施氮量水平下，随着生育进程的推进，转基因材料穗的氮素积累量逐步增加；叶的氮素积累量逐渐降低；茎秆的氮素积累量先增加后降低。同一生育时期随着施氮量的增加，转基因材料穗的氮素积累量先增加后降低，在N230处理最高；叶的氮素积累量逐渐降低；茎秆的氮素积累量先降低后升高。各营养器官的氮素积累量表现为：穗＞叶＞茎秆，说明穗是氮素再分配的重要组织器官；而不同生育时期表现为：扬花期＞灌浆期＞成熟期，说明扬花期是影响大麦氮素再利用的关键时期。

比较氮素积累比例结果（表2）表明，对于穗部，扬花期为23.59%~44.00%，灌浆期为31.04%~69.99%，成熟期为36.50%~68.01%；对于叶片，扬花期为35.00%~49.98%，灌浆期为8.21%~32.55%，成熟期为18.49%~32.67%；对于茎秆，扬花期为20.94%~29.72%，灌浆期为21.00%~44.40%，成熟期为12.10%~34.08%。由此表明，随着生育进程的推进和施氮量增加，各营养器官的氮素积累占比发生变化，说明施氮量会影响氮素在大麦各营养器官的转移和再分配，进而调控大麦籽粒的形成及进程。

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2.2.3 转基因大麦的氮素转运及利用 养分的转运量和转运效率是表征营养体养分向籽粒转移量的重要指标。植物利用氮主要涉及氮的吸收、同化、转运、循环和再活化。不同植物对氮素的利用效率不同，同一作物不同品种对氮素的利用效率也存在差异。由表3可知，转基因材料营养器官的氮素转运量、氮素转运率及氮素转运量对穗的贡献率和氮转移量在中氮水平下较高，在高氮水平下有所降低；而对照在高氮水平下较高。转基因大麦氮肥农学利用率、氮肥偏生产力均随着施氮量的增加逐渐降低，即在低氮水平下较高。

表3 不同大麦营养器官的氮素转运量、转运率、干物质转运量、转运率及氮肥农学利用率和氮肥偏生产力Table 3 Nitrogen transfer rate， transfer rate， dry matter transfer rate， transfer rate， agronomic utilization rate of nitrogen fertilizer， partial productivity of nitrogen fertilizer in different barley vegetative organs

2.3 不同生育时期，转基因大麦籽粒产量与各营养器官氮素含量的相关性

花后氮素的同化和转运是氮素再利用效率高低的重要影响因子。由表4可知，植株穗、叶中的氮素含量与籽粒产量形成和氮利用效率关系密切，主要表现为籽粒产量与扬花期穗的氮素含量呈显著正相关，相关系数为0.988；与灌浆期和成熟期穗氮素含量的相关系数分别为0.836和0.890；与扬花期、灌浆期叶氮素含量的相关系数分别为0.900和0.866；与扬花期、灌浆期茎秆氮素含量的相关系数分别为0.923和0.908。随着生育进程的推进，单株产量与各营养器官氮素含量的相关性逐渐降低，说明扬花期是籽粒产量形成的关键时期，且籽粒氮素来源更多依赖于前期地上部营养体中的氮素转移。

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3 讨论

氮素是植物生长必需的大量营养元素，参与植物蛋白质、氨基酸、酶、叶绿素等的生物合成。氮肥运筹是作物优质高产栽培的重要内容，研究各生育期根、茎、叶、穗中氮素积累、转移和再分配对作物高产具有重要意义[16]。沈会权等[17]研究表明，施用氮肥可显著提高不同时期叶和茎秆中的氮素含量及籽粒中的蛋白质含量。蔡剑[18]研究表明啤酒大麦的花前植株氮素积累量和转运量均随着施氮量的增加呈上升趋势。如何降低氮肥投入、减轻作物对氮素依赖、提高作物的氮素利用效率、剖析作物的低氮耐受性机理成为植物营养研究的热点。

植株生长发育过程中氮素的运转和利用主要经历3个阶段：①种子萌发阶段，储藏的氮素活化为萌发提供能量；②扬花期至灌浆期营养生长阶段，包括氮素的同化、分配及转运；③成熟期，植株逐渐衰老，根、茎秆和叶中的氮素回归自然[19]。花后是禾谷类作物籽粒形成的关键阶段，大部分营养器官的氮素和碳水化合物向籽粒转移[20]。本研究中低醇溶蛋白转基因大麦扬花期穗的氮素积累量较高，成为籽粒氮素的主要来源，且主要通过增加植株分蘖数、保证有效穗数来确保籽粒产量。花后氮素的同化和转运是氮素再利用效率高低的重要影响因子。小麦开花期叶片、茎杆、穗及成熟期籽粒氮素积累量与籽粒产量呈极显著正相关[21]。本研究也表明转基因大麦穗、叶中较高的氮素积累和分配与籽粒产量呈显著正相关。

养分的转运量和转运效率是表征营养体养分向籽粒转移量的重要指标。氮素在植株体内的分配情况决定了氮素的再利用能力[22]。不同植物对氮素的利用效率不同，同一作物不同品种对氮素的利用效率也存在差异。左青松等[23]研究表明，在作物生长后期土壤中的氮素被吸收耗尽，植株营养器官中的氮素最大化转移给穗部以完成籽粒后熟，而叶和茎秆衰老凋零，进而实现氮素的高效利用。董桂春等[24]认为作物根系吸收的氮素由茎秆逐渐流动到叶和籽粒，各器官间氮素的同化和流动影响籽粒氮素的积累，从而影响作物生育后期的氮素再利用效率，并最终影响籽粒产量。徐寿军等[16]研究表明，随着施氮量的增加大麦花后氮素积累率及其对籽粒的贡献率均呈上升趋势，而各器官氮素转运率及对籽粒的贡献率呈下降趋势，且高氮与低氮处理间差异显著。本研究表明，低醇溶蛋白转基因大麦地上部的氮素积累量在不同生育期表现为：扬花期＞灌浆期＞成熟期，且扬花期氮素积累量较高，说明充足的花前氮素积累为花后灌浆结实奠定了物质基础；从地上部植株氮素总积累量来看，转基因材料在各氮素水平下的氮素总积累量均高于对照，说明转基因材料的氮素吸收利用能力较强。

高润红等[25]研究表明，氮利用率的提高主要是由于氮素吸收效率提高引起的。德木其格[26]认为，在施氮量为180 kg·hm-2时大麦的氮素利用率达到峰值，其叶片和茎秆的氮素转运率及其对籽粒贡献率、氮肥生产效率、氮肥生理效率均随着施氮量的增加呈先降低后升高趋势，氮肥农学效率和氮肥偏生产力呈降低趋势。苏丙华等[27]研究发现，小麦籽粒产量随着施氮量的增加逐渐增加，而氮肥农学利用率、氮肥生产效率和氮肥吸收效率均逐渐降低。张如标等[28]研究显示，增施氮肥虽可显著提高大麦产量，但降低了氮肥偏生产力和氮肥农学利用效率。张金灿等[15]研究表明，大麦的氮素转运效率和氮肥生理利用率随着施氮量的增大均表现为先增大后减小。本研究表明，随着施氮量的增加，低醇溶蛋白转基因大麦的氮肥农学利用率和氮肥偏生产力均逐渐降低，在160 mg N·kg-1土时氮肥农学利用率和氮肥偏生产力最高，分别为5.42%和11.74。