基于SSR和SRAP标记小麦资源遗传多样性及农艺性状分析

许娜丽， 余慧霞， 姚明明， 王彦青， 李清峰， 刘彩霞， 孙刚，陈佳静， 龙姣卉， 王掌军*

（1.宁夏大学农学院， 银川 750021；2.信阳市农业科学院， 河南 信阳 064000）

小麦（Triticum aestivumL.）作为世界和我国重要粮食作物之一，是全球约35%～40%人口的主食，提供人类约21%的食物热量和20%的蛋白质，其产量高低和品质优劣直接关系国家粮食安全和人民生活水平[1-3]。目前，由于少量骨干亲本的高频利用和育种选择，导致大量优异基因流失，品种资源的遗传多样性日益狭窄。而小麦遗传多样性的开发是品种改良的基础，对小麦育种起重要作用[4-5]。目前，小麦遗传多样性研究多基于表型和分子标记分析，表型性状受基因显隐性关系及环境条件的影响，造成其多样性分析结果不稳定；分子标记体现了DNA水平上的遗传差异，能更深入、稳定地分析小麦品种资源的遗传多样性[6]。目前，国内外学者利用简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）、简单重复间序列（inter-simple sequence repeat，ISSR）、序列相关扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）和单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）等分子标记研究小麦的遗传多样性，分析了小麦品种资源的遗传基础和亲缘关系[7-15]。王秋云等[16]利用SSR标记对引自国际玉米小麦改良中心（International Maize and Wheat Improvement Center，CIMMYT）的56份人工合成小麦进行分析，发现人工合成小麦较栽培品种具有更高的遗传多样性。张思妮等[17]基于102对SSR标记对128份国内外小麦进行分析，其多态性信息含量（polymorphism information content，PIC）为0.248～0.897，平均0.724，表明小麦的遗传多样性较高。Wang等[18]利用62个SSR标记对238个国外小麦品种进行遗传多样性分析，平均每个SSR标记有19.37个等位基因，其PIC值为0.760，表现出较高的遗传多样性水平。Dong等[19]利用30个SRAP标记分析了15份以色列野生小麦的遗传多样性，其Nei’s多样性指数（H）和Shannon指数（I）分别为0.198和0.295，表现出较低的多样性水平。Hassan等[20]利用36对有多态性的SRAP标记对内蒙古地区的50份春小麦材料的多样性进行研究，表明地理来源相同的春小麦品种之间遗传差异较小，种植区域的环境（自然选择）是影响春小麦亲缘关系的重要因素。赵小庆等[21]利用17对SRAP标记对7个内蒙古春小麦品种进行分析，其PIC、有效等位基因数（Ne）、I分别为0.630、1.601、0.710，表明研究材料遗传变异较大。小麦产业未来发展面临提升质量、降低成本和环境保护3大挑战。宁夏作为北方主要春麦区之一，本地品种资源相对匮乏，且亲缘关系较近，遗传多样性日趋狭窄，这些已成为制约宁夏小麦新品种选育的瓶颈。因此，本研究基于课题组前期对251份小麦种质资源主要农艺与品质性状遗传多样性的分析[22]，利用SSR和SRAP标记对其进行DNA水平上的遗传多样性分析，以期明确品种间的亲缘关系和遗传差异，结合不同类群品种的农艺与品质性状表现，挖掘优异育种亲本，指导杂交组合配制，为宁夏小麦遗传改良及新品种选育提供优良基因资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以来自国内外的251份小麦品种资源（表1）为研究对象，均由宁夏大学小麦育种课题组提供。材料包括205份育成品种，其中宁夏51份，国内其他省（自治区、直辖市）151份，国外3份；46份地方品种，其中宁夏8份，国内其他省（自治区、直辖市）31份，国外7份。

表1 供试材料编号与名称Table 1 Code and name of the test materials

表1 供试材料编号与名称Table 1 Code and name of the test materials 续表Continued

表1 供试材料编号与名称Table 1 Code and name of the test materials 续表Continued

于2020和2021年将251份小麦品种种植在宁夏大学教学实验农场（38°13′3″N，106°14′12″E）。试验地属中温带干旱气候区，海拔1 110 m，有效积温3 300 ℃，平均气温8.5 ℃，年降水量180～200 mm，土壤为灌淤土，肥力中等，可扬黄自流灌溉。2年材料均种植在地力、水肥条件均一的同地段，每个材料种植5行，行长1.10 m，行距0.20 m，田间管理同大田。

1.2 农艺性状考察

农艺性状考察参照《小麦种质资源描述规范和数据标准》[23]，每个性状设置15次重复。其中，株高、穗下茎长和穗长均采用卷尺测量；有效小穗数为每个单株上的总小穗数；不孕小穗数为各小花均不结实的小穗数目；结实小穗数为每穗均结实的小穗数。其中，结实小穗数与不孕小穗数的和为有效小穗数。穗粒数和穗粒重为每个株系随机选取15个单穗统计粒数并称重，取平均值；千粒重为1 000粒籽粒质量。经济系数为经济产量与生物学产量的比值，其中，生物学产量为收获晾干后未脱粒前的植株质量，经济产量为脱粒后的籽粒质量。

1.3 品质性状测定

用瑞典DA7200型近红外品质分析仪测定籽粒水分、粗蛋白和湿面筋含量及出粉率、吸水率、降落值、沉降值、硬度指数和容重共9个籽粒品质性状，每个样本分别取约30 g，5次重复，在国家小麦改良中心西北分中心（银川）进行测定[24]。

1.4 分子标记分析

基因组DNA提取采用CTAB法[25]。SSR和SRAP标记均为已发表引物，其中能够在群体中稳定扩增的47对SSR和25对SRAP（Me-与Em-组合）引物信息详见表2，以上引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 SSR与SRAP引物编号及序列Table 2 Code and sequence of SSR and SRAP primers

表2 SSR与SRAP引物编号及序列Table 2 Code and sequence of SSR and SRAP primers 续表Continued

表2 SSR与SRAP引物编号及序列Table 2 Code and sequence of SSR and SRAP primers 续表Continued

PCR 反应体系为 10 µL，包含 10×Reaction Buffer 2 µL，dNTPs (2.5 mmol·L-1) 0.8 µL，上、下游引物 (10 µmol·L-1) 各 0.2 µL，TaqDNA 聚合酶(5 U·µL-1) 0.1 µL，模板 DNA (50 ng·µL-1) 1 µL，ddH2O 5.7 µL。SSR 标记的 PCR 程序为：94 ℃3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，34～40个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。SRAP标记的PCR 程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，35 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，5 个循环；94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。扩增产物采用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电压为180 V，1.5 h左右，银染后观察拍照。

1.5 数据统计与分析

采用Excel 2010对分子标记的扩增结果进行统计，相同迁移位置上出现条带记为“1”，无条带记为“0”。用PopGen 32软件计算各多态性引物的有效等位基因数（Ne）、Shannon信息指数（I）、Nei’s多样性指数（H）[26]。采用MEGA 5软件中的非加权成对算术平均法（unweighted pair group method with arithmetic average，UPGMA）进行聚类分析，绘制聚类图[27]。多态性信息含量(PIC)[28]的计算公式如下。

式中，Pij表示标记i的第j个带型出现的频率；PIC值的大小反映多态性的高低，PIC值最大为1，表示非常高的多态性；最小值为0，表示无多态性。

2 结果与分析

2.1 小麦品种资源农艺与品质性状分析

对251份小麦品种资源的10个农艺和9个品质性状进行分析，结果如表3所示。251份材料中蕴含着丰富的遗传变异。农艺性状的变异系数为14.25%～41.77%，其中，分蘖数、穗粒重的变异系数较大，分别为41.77%、36.58%；小穗数、结实数的变异系数较小，分别为14.43%、14.25%。品质性状变异系数为2.24%～15.42%，其中，沉降值、降落值、湿面筋的变异系数较大，分别为15.42%、9.23%、9.15%；出粉率、容重的变异系数较小，分别为3.18%、2.24%。总体来看，农艺性状的变异系数明显高于品质性状的变异系数。

表3 251份小麦品种资源的农艺性状与品质性状Table 3 Agronomic traits and quality traits of 251 wheat cultivar resources

2.2 小麦品种资源遗传多样性分子标记分析

2.2.1 SSR与SRAP标记多态性引物筛选 选取提摩菲维小麦、中国春、苏麦3号、甘育2号和宁春4号这5份农艺性状存在显著差异（P＜0.05）的小麦品种用于引物的筛选，结果如表4所示。747对SSR引物共筛选出153对，多态性比例为20.48%，其中能够在群体中稳定扩增的有47对；SRAP引物中，12条正向引物和64条反向引物相互组合共筛选出96对，多态性比例为12.73%，能够在群体中稳定扩增的有25对。

表4 多态性引物筛选数目和比例Table 4 Number and proportion of polymorphism primer screening

2.2.2 SSR与SRAP标记多态性信息量分析 利用能够稳定扩增的45对SSR引物对251份小麦品种资源进行多样性分析，共检测到234个等位变异，不同位点等位变异数为3～11，平均4.979。引物的有效等位基因数（Ne）、基因多样性指数（H）、Shannon信息指数（I）分别为1.103～1.772、0.089～0.429、0.181～0.618，平均值分别为 1.474、0.289、0.445，其中，引物XbarcM156的Ne、H、I均最大，分别为1.772、0.429、0.618；多态性信息量（PIC）为0.097～0.862，平均0.652，引物Xbarc78的PIC最大（表5）。

25对稳定扩增的SRAP引物在251份小麦品种资源中共检测出342个等位变异，不同位点的等位变异数为6～21，平均13.680。SRAP引物的Ne、H、I分别为 1.152～1.734、0.125～0.403、0.235～0.584，平均值分别为 1.429、0.257、0.399，其中，Me5-Em62的Ne、H、I均最大，分别为1.734、0.403、0.584；PIC为0.651～0.932，均大于0.500，平均为0.826，属于高多态性水平，引物组合Me7-Em44的PIC最大（表5）。

表5 251份小麦品种资源SSR与SRAP标记多态性信息量Table 5 Polymorphic information of SSR and SRAP markers in 251 wheat cultivar resources 续表Continued

表5 251份小麦品种资源SSR与SRAP标记多态性信息量Table 5 Polymorphic information of SSR and SRAP markers in 251 wheat cultivar resources 续表Continued

2.2.3 基于SSR与SRAP标记的小麦品种资源聚类及农艺品质性状分析 利用2种标记共72对引物的扩增结果对251份小麦品种资源进行聚类分析，结果如图1所示。将251份材料分为4个类群，其中，类群Ⅰ包括100份材料（C129～C230），主要为北方春麦区品种，其株高适宜，以宁夏、甘肃春性品种居多，分别为45、31份，其中，2份河南品种及1份四川品种被聚在此类群中；类群Ⅱ包括39份材料（C145～C157），主要为华北地区和中原地区的冬性品种；类群Ⅲ包括81份材料（C99～C126），其株高偏低，主要是以江苏省为代表的长江中下游地区的弱冬性品种；类群Ⅳ包括31份材料（C19～C26），主要为国内外地方品种和人工合成种，其中，宁春20号、宁春21号、宁春35号为宁夏早期选育品种，这一类群的主要特点是株高较高，易倒伏，但品质性状优异。

图1 基于SSR和SRAP标记的小麦品种资源聚类Fig. 1 Dendrogram based on SSR and SRAP marker of wheat cultivar resources

进一步分析4个类群的农艺与品质性状，结果（表6和7）表明，类群Ⅰ的穗长最长，结实数、穗粒数、穗粒重、千粒重、出粉率、容重、硬度指数均最高，水分含量最低；类群Ⅱ的分蘖数、降落值均最高；类群Ⅲ的株高最矮，经济系数最高；类群Ⅳ的穗下茎长、小穗数、粗蛋白含量、湿面筋含量、吸水率、沉降值均最高。对4个类群的农艺性状和品质性状进行差异性分析，结果发现，各类群间的农艺与品质性状存在显著或极显著差异（P＜0.05和P＜0.01），尤其各个类群间在株高、穗下茎长、千粒重、粗蛋白含量上存在极显著差异。

表6 4大类群的农艺性状Table 6 Agronomic traits of 4 groups

表7 4大类群的品质性状Table 7 Quality traits of 4 groups

3 讨论

小麦新品种的培育对世界和我国粮食安全作出了重大贡献。目前，大多育成品种所聚合的优良基因位点较为相似，变异空间狭小，亲缘关系较近，而且由于商业化育种，多数杂交组合的亲本选配均围绕高产品种，忽视了其他性状，导致新培育的品种（系）间遗传相似性不断升高，品种资源的遗传多样性日趋狭窄[29-30]。拓宽小麦育成品种的遗传多样性迫在眉睫。研究表明，通过扩大引种来源[31]；重视对古老地方品种与农家品种中蕴含的优异性状[32]；充分挖掘小麦野生近缘植物中蕴藏的丰富基因源；加强对小麦野生近缘植物的保护力度以及利用远缘杂交将近缘种（属）的优异基因导入小麦等措施对丰富小麦资源类型、拓宽遗传基础、创新品种资源具有重要现实意义[33]。本研究选取了251份小麦品种资源，有小麦近缘属，如黑麦、大麦；有亲缘种，如栽培一粒小麦、硬粒小麦、东方小麦等；有合成小麦，如‘小黑麦’‘小大麦’‘荆辉1号’等；还有国外小麦（‘素诺拉64’）及国内不同麦区的农家品种、地方品种及新育成品种，这些资源对于丰富宁夏小麦品种资源类型具有重要补充作用。

小麦遗传多样性的开发是改良现有品种的基础。研究技术和手段对小麦遗传多样性评价的准确性有很大影响。表型性状属于数量性状，受栽培措施、生态环境等影响，存在一定的局限性；而分子标记在基因水平上反映了不同品种资源之间的遗传差异。已有大量研究利用不同类型分子标记分析了小麦遗传多样性，但研究结果却不尽相同[27,34-35]。本研究采用了SSR和SRAP标记，这2种类型分子标记具有一定的互补作用，其中SSR标记数量丰富，覆盖整个基因组，主要表现为3～5个碱基的差异；SRAP标记因个体品种开放阅读框（open reading frames，ORF）序列长度差异不同，放大基因的开放阅读框，与随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）和ISSR相比，SRAP标记表现出更高的稳定性和多态性[36]。本研究利用这2种标记分别对251份小麦品种资源的遗传多样性进行分析，其SSR标记的多态性信息量与Abbasabad等[37]研究结果基本一致，但低于Salehi等[38]的研究结果；SRAP标记多态性信息量显著高于Hassan等[20]的研究结果，这可能由于供试材料在数目、类型和遗传差异等不同所致。另外，本研究中2种标记的多态性信息量基本保持一致，因此，结果具有一定的可靠性。

依靠科技发掘优良基因对栽培品种进行遗传改良，是解决人类对粮食需求的根本途径。本研究利用2种标记将小麦品种资源聚为4个类群，其中类群Ⅳ具有丰富的遗传多样性，与其他类群间表现出明显的遗传差异，这与胡立芹等[39]和郑军等[40]研究结果基本一致，而与王凤涛等[41]研究结果存在差异，可能是由于材料的数量、来源及标记类型不同所致。对不同类群的农艺与品质性状进行分析发现，各类群间的农艺与品质性状存在显著或极显著差异，其中类群Ⅰ的穗粒数、穗粒重、千粒重均最高，可作为小麦产量性状改良的亲本加以利用；类群Ⅳ大多为地方品种，其粗蛋白和湿面筋含量较高，可用于改良小麦品质性状。目前，宁夏审定的多数小麦品种与‘宁春4号’的亲缘关系较近，遗传背景日趋狭窄，严重限制了宁夏小麦产业的可持续发展[42]。本研究中的251份小麦品种资源之间遗传多样性较丰富，结合聚类和农艺、品质性状分析结果，可选用综合性状优异且有一定遗传差异的材料作为育种亲本，对宁夏小麦品种改良和拓宽小麦遗传多样性具有一定的现实意义。