HPLC-CAD 法同时测定八珍益母丸的3 种成分

张 超

（开封市中医院，河南 475000）

八珍益母丸收载于《中国药典》2020 版，具有益气养血、活血调经的功效，用于气血两虚兼有血瘀所致的月经不调，症见月经周期错后、行经量少、淋漓不净、精神不振、肢体乏力［1］。明·张景岳《景岳全书》中记载，八珍益母丸主治血气两虚，月经不调。明·叶文龄的《医学统旨》中记载，八珍益母丸补气血，调月经［2-3］。本试验首次建立了HPLC-CAD 法同时测定八珍益母丸中盐酸水苏碱、盐酸益母草碱和猪苓酸C 3 种有效成分的方法，所建立的分析方法简单、灵敏度高、专属性好，可应用于八珍益母丸的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Thermo Ultimate 3000 高效液相色谱仪，配置Corona Veo 电雾式检测器（变色龙工作站，美国赛默飞公司）；BSA124S 型电子天平（德国赛多利斯公司）；KQ-5000 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药 盐酸水苏碱对照品（批号110712-201614，质量分数100%）、盐酸益母草碱对照品（批号111823-201704，质量分数95.2%）均购自中国食品药品检定研究院；猪苓酸C 对照品（批号20210902，质量分数99.8%）购于上海百悦生物技术有限公司；水为超纯水，甲醇、乙腈均为色谱纯（美国Fisher 公司），其他试剂均为分析纯。八珍益母丸（长春新安药业有限公司，批号20220801、20220805、20220807）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Ultimate XB-Phenyl 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈为流动相A，10 mmol/L 甲酸铵（甲酸调pH 值至4.0）为流动相B，梯度洗脱，洗脱程序见表1；柱温35 ℃，流速1 ml/min，进样量10 μl。CAD 雾化器温度35 ℃，过滤常数为5.0，采集频率为10 Hz。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取盐酸水苏碱、盐酸益母草碱与猪苓酸C 对照品适量，加甲醇制备成含盐酸水苏碱550 μg/ml、盐酸益母草碱450 μg/ml 与猪苓酸C 12 μg/ml 的对照品母液，分别精密取对照品母液适量，置于同一量瓶中，加甲醇配制不同浓度的对照品溶液，摇匀，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得系列混合对照品溶液，见表2。

表1 梯度洗脱程序

表2 混合对照品系列浓度溶液 μg/ml

2.2.2 供试品溶液的制备 取大蜜丸，剪碎，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 ml，超声处理（功率250 W，频率30 kHz）30 min，放至室温，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密取续滤液1 ml，置5 ml 量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 按工艺同法制成缺益母草和茯苓的阴性样品，分别按“2.2.2”项下方法制成的阴性对照溶液。

2.3 系统适用性试验 取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μl，依“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图，阴性对照溶液在与对照品和样品溶液相应的位置上无干扰，见图1。

图1 对照品（A）供试品（B）阴性样品（C）高效液相色谱图

2.4 线性范围 取“2.2.1”项下系列混合对照品溶液，依“2.1”项下色谱条件进样，记录峰面积。以对照品溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行方程回归，结果盐酸水苏碱、盐酸益母草碱与猪苓酸C 在以下线性范围内均呈良好线性关系，见表3。

表3 含量测定回归方程及线性范围

2.5 精密度试验 取混合对照品溶液，依“2.1”项下色谱条件，连续进样6 次，记录盐酸水苏碱、盐酸益母草碱与猪苓酸C 峰面积，RSD 分别为2.26%、1.38%和3.18%，表明精密度良好。

2.6 稳定性试验 取供试品溶液（批号20220801），分别在第0、2、4、6、8、12、18、20 和24 h依“2.1”项下色谱条件进样，记录盐酸水苏碱、盐酸益母草碱与猪苓酸C 峰面积，RSD 分别为1.92%、1.54%和1.44%，表明供试品溶液24 h 内稳定性良好。

2.7 重复性试验 取八珍益母丸6 份（批号20220 801），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，依“2.1”项下色谱条件进样，记录盐酸水苏碱、盐酸益母草碱与猪苓酸C 峰面积，测得八珍益母丸中盐酸水苏碱含量0.689 mg/g、盐酸益母草碱0.592 mg/g、猪苓酸C 0.158 mg/g，RSD 分别为1.23%、1.62%和2.82%，均小于3%，表明方法的重复性良好。

2.8 耐用性考查 取同一样品（批号20220801），按照“2.2.2”项下方法制备成供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行分析。分别对色谱条件的微小变化进行考查，包括柱温、流速、色谱柱等对测定结果的影响。结果显示，色谱条件的微小变化对样品的测定基本没有影响，表明方法的耐用性好。

2.9 加样回收率试验 取已知含量样品1 g（批号20220801），精密称重，分别精密加入低、中、高浓度的对照品溶液各3 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液。依“2.1”项下色谱条件进样，记录峰面积，计算加样回收率，盐酸水苏碱、盐酸益母草碱、猪苓酸C平均加样回收率分别为99.39%（RSD 为0.98%）、98.84%（RSD 为0.94%）和100.11（RSD 为1.09%），平均加样回收率为98%～102%，RSD≤2.0%。结果见表4-6。

2.10 含量测定 取3 批八珍益母丸（批号分别为20220801、20220805、20220807），按照“2.2.2”项下方法制备样品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定酸水苏碱、盐酸益母草碱与猪苓酸C 含量，结果见表7。

表4 盐酸益母草碱加样回收率试验结果

表5 盐酸水苏碱加样回收率试验结果

表6 猪苓酸C 加样回收率试验结果

表7 含量测定结果（n=3）mg/g

3 讨论

八珍益母丸由益母草、熟地黄、当归、党参、炒白术、酒白芍、川芎、茯苓与甘草9 味中药组成，方中重用益母草，活血化瘀，调经止痛，为君药；熟地黄、当归、白芍、川芎养血活血；党参、白术、茯苓、甘草益气健脾，共为臣药；诸药合用，消补兼施，益气养血，活血调经。

文献中对于该中成药的质量研究均为基于多指标成分的含量测定，有HPLC-UV 法［4］、HPLC-ELSD法［5］、HPLC-MS［6］等。由于HPLC-MS 的仪器成本高，HPLC-ELSD 法的灵敏度低，HPLC-UV 法对于无紫外吸收物质检测的局限性，本试验尝试采用电雾式检测器［7］（CAD）对于该中成药中紫外吸收较弱的成分进行研究。

本试验对供试品的提取方式进行了考查，提取方式包括超声提取和索氏提取，试验证明超声提取就可以满足需要。同时对于提取溶剂进行了考查，如乙醇、甲醇、不同比例的乙醇水溶液等，优选70%的乙醇水溶液。最后，对于提取时间进行了考查，考查的提取时间包括10、20、30、40 和50 min，优选30 min，最终确定了供试品的提取条件。

本试验对于色谱条件进行了系统的优化，由于CAD 检测器对于流动相的要求，流动相中仅可添加挥发性的添加剂，因此对于甲酸铵体系、乙酸铵体系、甲醇体系、乙腈体系分别进行了考查，甲酸铵体系的基线更好，优选甲酸铵体系。同时对于不同填料的色谱柱进行了考查，包括苯基柱、C8柱、C18柱等，优选苯基柱，在此基础上对方法进行了优化。最后对确定的方法进行了系统的验证，方法学考查结果良好，故本文采用该方法作为八珍益母丸3 种指标成分的含量测定方法。

综上可见，HPLC-CAD 法测定盐酸水苏碱、盐酸益母草碱与猪苓酸C 的含量，测定结果准确、操作方便，可用于八珍益母丸的质量控制，可为八珍益母丸质量标准提高提供参考和依据。