宫颈癌预后与泛素蛋白1 及免疫细胞群表达特征的关联性

马宁，张越

随着医疗技术及手术条件的不断提升，宫颈癌根治术很大程度上延长了宫颈癌患者生存时间，降低了疾病病死率。但临床统计数据显示，经宫颈癌根治术联合术后规范化辅助治疗后，宫颈癌后期复发率依旧在10%～20%［1］。

宫颈癌的具体致病机制尚不清楚，但免疫功能紊乱与宫颈癌的发生与发展密切相关［2-3］。有研究发现［4］，宫颈癌患者的免疫细胞群失衡，并影响其预后。泛素蛋白1（ubiquilin 1，UBQLN1）是维持细胞内蛋白质稳态的重要物质，能促进错误折叠蛋白质降解，参与细胞自噬、凋亡等，在多种恶性肿瘤内呈高表达，并可应用于恶性肿瘤患者预后判断中［5］。本研究通过分析宫颈癌患者免疫细胞群以及癌灶组织内UBQLN1 表达情况与其临床病理特征及预后之间的关系，旨在探求宫颈癌可能的致病及复发机制。

1 对象与方法

1.1 研究对象

将2018 年6 月至2020 年1 月晋城大医院收治的98 例宫颈癌患者纳为观察组。（1）纳入标准：患者均符合手术指征，行宫颈癌根治术；术后病理检查证实为宫颈癌；参照《宫颈癌诊治指南》（2012 年）［6］中相关内容行术后规范化治疗；随访至2022 年1 月，且随访资料完整。（2）排除标准：合并其他恶性肿瘤者；既往接受过手术治疗或放化疗者；临床资料缺失者。（3）病例资料：98 例宫颈癌患者年龄42～65 岁［（51.11 ± 10.15）岁］，绝经者55 例，国际妇产科联盟（FIGO）分期：Ⅰ期50 例，ⅡA 期48 例，分化程度：中高分化者60 例，低分化者38 例，合并淋巴转移者35 例，癌灶直径＜4 cm 者47 例，≥4 cm 者51 例。同时将同期于同一医院行健康体检的60 例同年龄段女性纳为对照组，对照组健康体检均合格，无免疫性疾病或恶性肿瘤，年龄40～66 岁［（53.45 ±8.79）岁］，其中绝经者30 例，且年龄及绝经情况与观察组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 外周血免疫细胞群检测 对照组于入组后采集其外周静脉血5 ml，观察组在术前抽取其外周静脉血5ml。检测仪器为FACSCalibur 流式细胞仪（BD Bioscience，San Diego，CA），检测试剂包括抗人CD4-FITC 抗体（eBioscience，Cat，NO.11-0048），抗人CD8-PE（eBioscience，Cat，NO.12-0097），抗人CD28-APC 抗体（eBioscience，Cat，NO.17-0289）。检测方法：采集被研究者外周血于肝素抗凝试管，立即送检，使用100 μl 全血与适当体积的相应抗体及同型对照抗体室温避光孵育30 min 后，加入2 ml专用红细胞裂解液室温避光孵育10 min，再加入5 ml 磷酸缓冲液（PBS），以1 000 r/min 离心10 min，离心半径为5.5 cm，弃上清液，洗涤3 次后采用流式细胞仪检测免疫细胞群分布情况。

1.2.2 免疫组化法检测UBQLN1 术中收集宫颈癌患者癌组织及癌旁组织，组织切片去蜡油。4 ℃下加入抗UBQLN1 抗体（1∶1 000，ab3341，Abcam）孵育过夜，PBS 洗涤3 次，然后加入HRP 偶联二抗（1∶300，K8002，Dako）室温孵育30 min，PBS 洗涤3 次，将染色切片与3'3-二氨基联苯胺反应10 min，0.1%苏木素反染。

结果判定：邀请2 名临床经验丰富的病理学医生分别读片，UBQLN1 表达量以染色强度及阳性细胞占比分数确定。强度记为0～3 分，没有棕色颗粒、浅棕色颗粒、中等棕色颗粒以及深棕色颗粒分别得0、1、2、3 分；阳性细胞占比记为0～3 分，阳性细胞占比＜10%、10%～39%、40%～69%、≥70%分别得0、1、2、3 分，染色强度及阳性细胞率乘积作为总得分，总得分≤3 分者为低表达者，＞3 分者为高表达者。1.2.3 随访及复发诊断 随访至2022 年1 月，统计宫颈癌患者复发率：由病理诊断、肿瘤再次出现部位活检及穿刺病理检查证实；对于发生远处转移者，如肺转移、骨转移等无法获得病理诊断者，依靠症状、体征以及辅助检查行临床诊断。

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0 统计软件处理所得数据。计量资料以±s表示，2 组间比较采用t检验；计数资料以百分比（%）表示，2 组间比较采用χ2检验。绘制受试者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评价外周血免疫细胞群及UBQLN1 表达量在预测宫颈癌术后复发中的效能。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 观察组与对照组外周血免疫细胞群检测结果比较

观察组外周血CD8+T 细胞占比高于对照组，CD4+/CD8+比值低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），2 组研究对象CD4+以及CD28+T 细胞占比比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 观察组与对照组外周血免疫细胞群检测结果比较（± s）

表1 观察组与对照组外周血免疫细胞群检测结果比较（± s）

组别例数CD4+/CD8+观察组对照组t 值P 值98 60 CD4+T 细胞（%）35.79 ± 6.69 37.48 ± 7.03 1.512 0.133 CD8+T 细胞（%）43.15 ± 7.48 31.03 ± 8.83 9.222＜0.001 0.83 ± 0.21 1.21 ± 0.15 10.059＜0.001 CD28+细胞（%）58.45 ± 10.47 57.66 ± 11.33 0.446 0.656

2.2 观察组患者宫颈癌组织与癌旁组织内UBQLN1 阳性率比较

宫颈癌组织内UBQLN1 阳性率高于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 观察组患者宫颈癌组织与癌旁组织内UBQLN1阳性检出率比较［例（%）］

2.3 观察组患者宫颈癌临床分期与外周血免疫细胞群及UBQLN1 阳性检出率之间的关系

宫颈癌临床分期为ⅡA 期的患者外周血CD4+T细胞占比以及CD4+/CD8+比值低于Ⅰ期，CD8+T 细胞占比低于Ⅰ期，差异有统计学意义（P＜0.05），其CD28+T 细胞占比以及UBQLN1 阳性检出率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 观察组患者宫颈癌临床分期与外周血免疫细胞群表达量及UBQLN1 阳性检出率之间的关系

2.4 观察组患者宫颈癌淋巴转移与外周血免疫细胞群表达量及UBQLN1 阳性检出率之间的关系

宫颈癌淋巴转移者CD4+T 细胞占比以及CD4+/CD8+比值低于无淋巴转移者，CD8+T 细胞占比高于无淋巴转移者，差异有统计学意义（P＜0.05），其CD28+T 细胞占比以及UBQLN1 阳性率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 观察组患者宫颈癌淋巴转移与外周血免疫细胞群表达量及UBQLN1 阳性检出率之间的关系

2.5 观察组患者宫颈癌组织分化程度与外周血免疫细胞群及UBQLN1 表达量阳性检出率之间的关系

宫颈癌低分化者外周血免疫细胞群占比与中高分化者比较差异均无统计学意义（P＞0.05），低分化者癌灶组织内UBQLN1 阳性检出率高于中高分化者，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表5。

表5 观察组患者宫颈癌组织分化程度与外周血免疫细胞群表达量及UBQLN1 阳性检出率之间的关系

2.6 观察组患者宫颈癌病灶直径与外周血免疫细胞群表达量及UBQLN1 阳性检出率之间的关系

宫颈癌病灶直径≥4 cm 者外周血CD4+T 细胞占比及CD4+/CD8+比值均低于＜4 cm 者，差异有统计学意义（P＜0.05）。其CD8+、CD28+T 细胞占比以及UBQLN1 阳性检出率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表6。

表6 观察组患者宫颈癌病灶直径与外周血免疫细胞群表达量及UBQLN1 阳性检出率之间的关系

2.7 观察组患者宫颈癌术后复发与外周血免疫细胞群表达量及UBQLN1 阳性检出率之间的关系

随访至2022 年1 月，共29 例宫颈癌患者确诊为复发，复发者外周血CD4+T 细胞占比以及CD4+/CD8+比值均低于未复发者，CD8+以及UBQLN1 阳性检出率均高于未复发者，差异有统计学意义（P＜0.05）。其CD28+T 细胞占比比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表7。

表7 观察组患者宫颈癌术后复发与外周血免疫细胞群表达量及UBQLN1 阳性检出率之间的关系

2.8 观察组患者外周血免疫细胞群表达量及UBQLN1 阳性检出率在预测宫颈癌术后复发中的价值

外周血免疫性细胞群CD4+/CD8+比值在预测宫颈癌术后复发中的效能最高，其AUC=0.951，95%CI（0.905～0.997），CD4+、CD8+、CD28+T 细胞单独应用时在预测宫颈癌术后复发时，CD4+效能最高，其AUC=0.829，95%CI（0.746～0.912），癌变组织内UBQLN1 阳性表达在预测宫颈癌术后复发中的 AUC=0.880，95%CI（0.784～0.935）。见 表8、图1。

表8 观察组患者外周血免疫细胞群表达量及UBQLN1 阳性检出率在预测宫颈癌术后复发中的价值

图1 观察组患者外周血免疫细胞群表达量及UBQLN11阳性检出率在预测宫颈癌术后复发中的价值

3 讨论

宫颈癌的发生与人乳头瘤病毒感染密切相关，但除此之外，机体免疫状态与宫颈癌的发生及发展也密切相关。机体的抗肿瘤免疫以细胞免疫为主，而T 细胞亚群是调控细胞免疫的中心，同时也是最重要的效应细胞。正常情况下，T 细胞各亚群均处于平衡状态，当机体发生病理改变时，免疫系统被激活，T 淋巴细胞亚群数量发生改变，免疫平衡状态被打破［7-8］。

有研究报道［9］，乳腺癌患者CD4+、CD3+水平降低，CD8+及血小板水平升高，且以上免疫因子与乳腺癌肿瘤直径、病理分级、分化程度、淋巴转移等病理因素关系密切。蒋立人等［10］研究发现，外周血CD3+、CD4+、CD8+T 细胞数量较低的高级别尿路上皮癌患者预后更差。

T 淋巴细胞是一类在胸腺分化并发育成熟的淋巴细胞，主要介导细胞免疫应答。本研究选择CD4+、CD8+以及CD28+T 细胞作为研究免疫细胞群，CD4+T 淋巴细胞可辅助与诱导前体细胞，识别瘤细胞分泌的可溶性抗原，并可激活B 细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞，活化抗体生成、巨噬细胞及细胞毒性T 淋巴细胞，放大其免疫效应，是抗肿瘤免疫中重要的免疫因子［11-13］。CD8+T 淋巴细胞是重要的效应细胞，可分为抑制性T 细胞与细胞毒性T 细胞，其中抑制性T 细胞具有负向调节作用，可抑制免疫活化，抑制B 细胞产生抗体，而细胞毒性T 细胞则可直接对抗肿瘤细胞、病毒等，发挥免疫功效［14-15］。CD28+是最重要的协同刺激分子，主要表达于T 淋巴细胞上，能提高T 淋巴细胞的反应性，诱导抗凋亡基因的表达［16-17］。

本研究结果显示，宫颈癌患者外周血CD8+T 细胞占比高于对照组，CD4+/CD8+比值低于对照组，CD28+及CD4+水平与对照组无异。提示与健康者相比较，宫颈癌患者机体免疫功能紊乱，CD4+/CD8+平衡被打破。本研究进一步分析发现，肿瘤分期为ⅡA 期者、合并淋巴转移者、肿瘤直径≥4 cm 者均存在CD4+/CD8+比值下降的特征，提示免疫细胞群CD4+/CD8+失衡与宫颈癌的发生及进展关系密切。

除了免疫功能外，泛素蛋白也与多种恶性肿瘤的发生及发展关系密切。UBQLN1 是泛素蛋白家族中的一员，Zhang 等［18］研究发现，UBQLN1 可通过mTOR/自噬/P53 信号通路介导肺癌A459 细胞增殖与凋亡，参与肺癌的发生。Feng X 等［19］研究发现，乳腺癌UBQLN1 表达水平上调，而抑制UBQLN1 则可抑制乳腺癌侵袭及子宫内膜异位症。Bao 等［20］研究发现，胃癌组织内UBQLN1 表达水平高于癌旁组织，且UBQLN1 高表达与患者不良预后关系密切。本研究发现，宫颈癌组织内UBQLN1 阳性检出率为81.63%，明显高于癌旁组织阳性检出率的54.08%，且低组织分化癌患者UBQLN1 检出率明显高于中高分化者，提示UBQLN1 表达量与宫颈癌组织分化程度有关。

宫颈癌术后复发的预测是患者最为关心的，准确预测宫颈癌术后复发风险，在临床工作中有着指导意义。为研究免疫细胞亚群及UBQLN1 在预测宫颈癌术后复发中的价值，本研究随访至2022 年1月，共统计出29 例复发。比较发现，复发者外周血CD4+T 细胞占比以及CD4+/CD8+比值均低于未复发者，CD8+T 细胞占比以及UBQLN1 阳性检出率均高于未复发者，提示外周血免疫细胞失衡，以及UBQLN1 过度表达均可能影响宫颈癌术后复发。

绘制ROC 曲线提示，CD4+/CD8+比值低于0.79，以及宫颈癌组织内UBQLN1 高表达在患者术后癌症复发中均具有良好的应用效能，可作为宫颈癌术后复发的预测参考指标。但受限于研究设计，本研究并未对免疫细胞群失衡与UBQLN1 表达量之间的关系进行深入研究，未探讨两者在宫颈癌复发中的作用机制，存在一定的缺陷，可作为下一步研究的方向。

综上所述，宫颈癌患者外周血免疫细胞群水平及UBQLN1 表达水平在预测患者术后复发中具有一定价值，可作为宫颈癌术后复发预测的潜在指标。