序贯移植方案在高龄不孕症患者冷冻胚胎移植周期的临床研究*

王 蕾，许淑芬

厦门大学附属第一医院生殖医学中心，福建 厦门 361003

高龄孕妇是指孕妇在35周岁以上分娩的人群。随着现代社会发展，职业女性多推迟生育，并且在我国二胎政策全面放开后，根据国家相关政策，符合二胎政策的育龄夫妇高达近9 000万对，其中女性年龄在40岁以上的夫妻比例超过半数，女性年龄在35岁以上的夫妻更是高达六成，因此高龄夫妇寻求生育的人数越来越多，高龄生育是现阶段许多女性需要面对的问题。在女性年龄增加的同时，高龄妇女卵巢功能下降，生殖细胞质量下降，其自然受孕几率下降［1］，需要去医院辅助生殖中心寻求帮助的患者越来越多。高龄不孕患者行辅助生殖技术（ART）的数量近几年呈明显上升趋势，高龄女性生育问题将面临巨大的医学挑战。在过去的临床实践中发现，高龄女性行ART助孕过程中，面临获卵少、可用胚胎数量少评分低、反复移植失败、流产率及胎儿畸形率高等临床妊娠结局不良问题。

早在1988年，国外学者就对胚胎序贯移植（SET）进行了探讨［2］，国内学者亦在既往行体外受精-胚胎移植（IVF-ET）失败患者行冷冻胚胎解冻移植（FET）中的SET 方案进行了研究［3-4］，但目前在高龄不孕患者FET 周期中应用SET方案的探讨尚未见专家提出指导意见。本研究通过对生殖医学中心高龄（年龄≥35岁）不孕女性冷冻胚胎解冻移植病例进行回顾性分析，为高龄女性FET方案选择提供新的临床思路，现将结果报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2017年7月—2021年5月厦门大学附属第一医院生殖医学中心行FET、年龄≥35 岁患者的150 例作为研究对象，按移植胚胎种类分为三组，A 组（序贯移植n=30）、B组（移植2枚卵裂胚n=60）和C组（移植2枚囊胚n=60）。本研究纳入标准：年龄≥35 岁。排除标准：年龄＜35 岁；有宫腔黏连、子宫内膜息肉/黏膜下肌瘤、宫腔积液等。

1.2 胚胎选择

患者冷冻/解冻胚胎按玻璃化冷冻/解冻胚胎。解冻后胚胎进行评估，卵裂胚：细胞数为7～9 个、细胞碎片＜10%、无多核化的胚胎定义为优质卵裂胚；囊胚：评分D5≥3BB、D6≥4BB的囊胚定义为优质囊胚［5-6］。

1.3 分组情况

内膜准备方案：月经及排卵规律的患者采用自然周期，阴道B超监测排卵，在B超确定排卵后D3移植卵裂期胚胎，排卵后D5 移植囊胚。月经及排卵不规律的患者采用激素替代周期准备内膜，月经周期第2～3 d 起口服芬吗通红片（含17β-E2，2 mg/片）4 mg/d×7 d，根据超声、激素水平调整药物用量，在使用芬吗通红片D14～15，内膜厚度在8 mm 以上，给予安琪坦200 mg/d 置阴道+达芙通20 mg/d 转化内膜，4 d 后行D3 卵裂胚移植，6 d 后行D5/D6囊胚移植。A组（序贯移植）为排卵后第3 d或激素替代周期孕酮转化第3 d移植1枚D3卵裂胚，排卵后第5 d移或激素替代周期孕酮转化第5 d植1枚D5/D6囊胚。B组（移植2枚卵裂胚）为排卵后第3 d或激素替代周期孕酮转化第3 d移植2枚D3卵裂胚。C组（移植2枚囊胚）排卵后第5 d 移或激素替代周期孕酮转化第5 d 植2 枚D5/D6囊胚。

1.4 移植后早孕诊断

卵裂胚移植14 d、囊胚移植11 d后，抽静脉血行人绒毛膜促性腺激素（HCG）检查确认妊娠；继续用药，在移植后4周左右，超声提示宫内见孕囊、胚芽及胎心搏动即判定为宫内妊娠，未见胚芽、胎心者，7 d 后复查彩超，若认为见胚胎、胎心则判定胚胎停育、流产。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0 软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，三组间比较采用F分析。计数资料以例数和百分比（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组患者一般临床资料

本研究共纳入FET 周期150 例，按子宫胚胎选择准备方案分为A 组、B 组和C 组。患者年龄35～42 岁，三组患者年龄、抗缪勒管激素（AMH）、基础性激素比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 三组患者一般临床资料（±s）

表1 三组患者一般临床资料（±s）

组别A组（n=30）B组（n=60）C组（n=60）F值P值年龄37.3±2.22 37.4±2.20 37.8±2.14 0.735 0.481 AMH（ng/mL）2.18±1.04 1.87±1.28 1.76±0.79 1.581 0.209 FSH（mIU/mL）8.04±2.25 8.60±2.55 8.07±1.89 1.039 0.357 LH（mIU/mL）5.81±1.82 5.15±1.15 5.29±2.12 1.489 0.229 E2（pg/mL）50.86±21.36 56.67±35.55 57.33±26.19 0.526 0.592 T（ng/dL）17.46±8.70 18.12±8.57 18.13±7.04 0.083 0.920 P（ng/mL）0.45±0.20 0.61±0.23 0.56±0.19 1.909 0.152

2.2 三组患者FET临床结局

三组患者的临床指标：孕酮转化日内膜厚度、移植优质胚胎率、多胎妊娠率和早期流产率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），但A 组患者临床妊娠率和胚胎种植率明显高于B、C 组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 三组患者FET临床结局（±s）

表2 三组患者FET临床结局（±s）

组别A组（n=30）B组（n=60）C组（n=60）F/χ2值P值转化日内膜厚度（images/BZ_32_2167_1986_2181_2019.png±s）10.04±1.53 10.34±1.53 9.81±1.41 1.959 0.145移植优质胚胎（%）93.33 94.17 91.67 0.589 0.745胚胎种植（%）31.67 15.83 25.83 6.569 0.037妊娠（%）56.67 30.00 41.67 6.042 0.049多胎妊娠（%）11.76 5.56 24.00 2.987 0.225早期流产（%）5.88 11.11 12.00 0.456 0.796

3 讨论

随着女性年龄增加自然受孕能力开始出现断崖式下降，流产率明显升高。ART经过40余年发展，胚胎冷冻、解冻移植技术日益成熟，高龄患者因自身条件受限，新鲜周期移植取消率明显高于年轻患者，冷冻胚胎解冻比率亦明显升高。目前大多数专家学者认为，在ART周期的移植胚胎选择方案为移植单个优质胚胎，能在保证较高妊娠率的同时能降低多胎妊娠率，是目前大多数辅助生殖中心选择移植胚胎的主要策略。但年龄是影响妊娠结局的重要因素［7］，高龄患者由于自身条件受限，难以获得质量较好的优质囊胚，因此胚胎移植后临床妊娠率一直处于较低水平［8］，高龄患者移植胚胎选择面临更多困难。在冷冻胚胎解冻周期中，高龄不孕患者由于常常需要多个取卵周期累积胚胎，获得优质胚胎不容易，需要个性化选择更好的方案移植以提高妊娠率。在临床上，FET的胚胎选择方式主要有卵裂胚移植、囊胚移植以及卵裂胚+SET。

SET方案的研究初衷在于提高患者的胚胎种植率以增加ART的成功率，Yazbeck等［9］的研究结果发现，在反复移植失败的患者中，冷冻胚胎解冻移植行SET妊娠结局明显高于纯卵裂期胚胎以及纯囊胚移植。张印峰等［10］国内学者也得出解冻周期SET能够显著提高RIF患者临床妊娠率、持续妊娠率及活产率的结论，尤其是SET 2枚胚胎在显著提高临床妊娠率和活产率的同时不增加多胎妊娠率，研究中认为SET 可成为RIF 患者的一种有效的治疗手段。合并RIF的多囊卵巢综合征（PCOS）患者行SET后临床妊娠率和胚胎种植率均得到显著提高［11］。

本研究结果显示，在高龄不孕患者行FET 周期中，SET 组妊娠率及胚胎种植率显著高于移植2 枚卵裂胚及2枚囊胚组。分析其原因可能有以下几点：第一，在序贯移植中，初次行胚胎移植时移植管伸入宫腔的操作是对子宫内膜形成机械性微刺激，这可能有利于胚胎着床［12］，其机制可能是刺激子宫内膜募集可促进胚胎着床的细胞因子，如白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）、γ-干扰素（IFN）、血管内皮生长因子（VEGF）等有利于增加子宫内膜容受性相关的因子分泌，以及白细胞抑制因子（LIF）、骨桥蛋白（OPN）等诱导胚胎着床相关的因子分泌。同时，巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤性细胞（NK）聚集活化增加，这能够促进上述相关因子的分泌表达，子宫自然杀伤性细胞可以促进血管新生，增加子宫内膜和内膜下血流，利于滋养细胞侵入［13］从而提高胚胎植入提高妊娠率。第二，SET周期第一个移植的胚胎（第3 d的卵裂胚）在种植进入子宫内膜后，导致环氧合酶2（COX 2）基因表达上调，前列腺素2（PG-2）生成增加，促进血管生成，诱导组织特异性子宫NK 细胞增殖，进而调节胚胎附着、子宫内膜重塑、抗氧化防御和囊胚周围免疫机制中的胚胎自分泌和母体旁分泌因子，增进了胚胎和内膜间的相互作用，这种作用使得内膜出现了“种植窗”状态，促进第二次移植的胚胎植入［14］。第三，SET中由于两次移植不同时期胚胎，第一个移植的卵裂胚种植后能诱导分泌的绒毛膜促性腺激素HCG，而HCG 的分泌促进白细胞介素-1（IL-1）分泌。IL-1作为重要的胚胎信号，多方面影响子宫内膜容受性促进胚胎着床。IL-1等细胞因子能促进白血病抑制因子（LIF）、前列腺素2（PGE2）等表达，这些细胞因子的分析均有增加子宫内膜容受性的作用，从而促进胚胎着床、提高妊娠率［15］。本研究结果还显示，SET组的多胎妊娠率、流产率与另外两组无显著差异，序贯移植并未显著增加多胎妊娠及流产风险，这与既往的研究结果一致［16-17］。

胚胎在体外培养至囊胚阶段能对胚胎进行进一步的评估和筛选，但因体外培养条件的受限、高龄患者胚胎发育潜能下降等众多因素，可能面临无囊胚移植风险，因此高龄SET存在一定的局限性。但有在FET周期中已经有多种胚胎选择的条件下，SET不仅可以应用在反复移植失败患者中，还可以作为一种相对能提高妊娠率而不增加多胎率、流产率的有效方案在高龄不孕患者FET中应用，国内学者［18］在对40岁以上超高龄反复移植失败患者冷冻胚胎SET结局的研究得到了与本次研究结果一致的结论。但是由于SET 在一次冷冻胚胎解冻周期中存在两次胚胎解冻，两次移植，在一定程度上增加了患者经济及时间成本，这也是临床工作中需要综合考虑的问题。

综上所述，冷冻胚胎移植周期中，SET对高龄不孕患者是一种有效的移植策略，但目前研究者收集临床样本量较少，还需要今后更大样本量的临床研究进一步探讨。