氢化珊瑚钙的氢化修饰、储氢性能分析及毒性*

成 昭,徐 玥,梁 飞,郑 蕾,龚 婕,李 根

(1.西安医学院 药学院,陕西 西安 710021;2.西安莱伯瑞生物工程有限公司,陕西 西安 710116)

代谢过程中产生的自由基,因其结构中存在未配对的自由电子,表现较高化学活性,常作为活性中间体广泛参与生命体内的各种氧化-还原反应[1-2]。自由基过量时,甚至可能引发氧化-还原过程失衡,损伤人体器官。其中,自由基氧化应激学说将机体衰老机制直指体内自由基。自由基氧化应激学说认为,机体衰老时,体内自由基含量增加,清除自由基的能力却无法与之平衡,从而导致自由基在体内过量积累,进而攻击细胞与结缔组织,造成细胞损伤,引发组织与器官功能紊乱,致使机体衰老。

为维持生命体内自由基的动态代谢平衡,降低过量积累的自由基可能产生的不良反应,机体依赖于各种抗氧化剂完成自由基清除。作为一种小分子,活性氢能够实现快速透皮、快速转运,同时,能够有效结合如羟基自由基等与氧化路径相关的自由基,从而加快机体代谢速度,达到抗氧化、抗衰老的功效[3-4]。天然来源的珊瑚钙,能够以其微孔结构进行氢储存[5-7],为研究人员开发微孔释氢的抗氧化材料提供了新思路。储氢珊瑚钙的研究,对于活性氢的抗氧化功效与机制分析、以及机体抗衰老均具有重要意义。

作者进行天然珊瑚钙的储氢实验,制备得到氢化珊瑚钙,并对天然珊瑚钙的主要成分碳酸钙、活性释氢物质氢化钙、珊瑚钙与所制备的氢化珊瑚钙,分别进行光谱性能研究,对比分析氢化珊瑚钙的特征光谱吸收,研究氢化珊瑚钙的储氢含量及其在不同温度时的释氢性能,进一步评价基于天然来源物质修饰得到的氢化珊瑚钙的毒性与抗氧化性。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

硫酸：质量分数70%,碳酸钙、氢化钙、珊瑚钙、锌粒、还原型辅酶Ⅰ(二钠)、氯化硝基四氮唑蓝(MTT)、2,2-联苯基-1-苦基肼基(DPPH)：上海阿拉丁试剂有限公司,以上试剂均为AR;N,N-二甲基亚砜(DMSO)：GR,上海阿拉丁试剂有限公司。

紫外分光光度计：UV-1700,日本岛津制作所;热重法-差示扫描量热法同步热分析仪：STA200,日本日立制作所;倒置荧光显微镜：U-LH 100HG IX73,日本奥林巴斯株式会社;多功能酶联检测仪：1510 Multiskan Go,美国赛默飞世尔科技公司。

1.2 氢化珊瑚钙的制备及紫外可见光谱测定

通过Zn与稀硫酸的制氢反应,同步实现制氢与天然珊瑚钙储氢,制备得到氢化珊瑚钙。

光谱分析：出射狭缝与入射狭缝宽度均为1 nm,扫描波段为350～600 nm,进行碳酸钙(天然珊瑚钙的主要成分之一)[5]、氢化钙(活性释氢物质)、珊瑚钙与所制备氢化珊瑚钙的紫外可见光谱测定,分析氢化珊瑚钙的特征光谱吸收与其在不同温度时的释氢性能。

1.3 氢化珊瑚钙的热失重分析

氢化珊瑚钙取样5 mg,在氮气氛围下,以20 ℃/min的速率进行升温,t=25～800 ℃测定所制备氢化珊瑚钙的热失重曲线,分析其储氢含量与氢缓释性能[5,8-9]。

1.4 氢化珊瑚钙的体外细胞毒性实验

以MTT比色法[10]进行氢化珊瑚钙的体外细胞毒性实验,首先制备人肝癌细胞株HepG2细胞悬液(对数生长期,密度为5×104个/mL),加入96孔板中,使每孔细胞数约8 000～10 000个,每组设置2个平行孔,将氢化珊瑚钙溶于杜尔贝科改良培养基(DMEM)中,以梯度递减的质量浓度依次加入96孔板的各个分组中(1 000、500、250、125、62.5、31.25 μg/mL),溶剂对照为含质量分数0.1% DMSO的DMEM完全培养基。加样后,将孔板置于37 ℃、体积分数5% CO2的细胞培养箱中,培养24 h。实验终止前,每孔加入MTT(5 mg/mL,20 μL),培养4 h,弃去培养液,每孔加入150 μL DMSO,测定490 nm处的吸光度OD值,进行HepG2细胞增殖抑制率计算,增殖抑制率=[(1-OD材料样液/OD对照)]×100%。

2 结果与讨论

2.1 氢化珊瑚钙的紫外可见光谱

对天然珊瑚钙的主要成分碳酸钙、活性释氢物质氢化钙、珊瑚钙与所制备的氢化珊瑚钙4种物质进行光谱性能研究见图1。

λ/nm图1 碳酸钙、氢化钙、珊瑚钙与氢化珊瑚钙的紫外-可见光谱

由图1可知,经过储氢活化过程,氢化珊瑚钙与珊瑚钙的紫外可见光谱呈现吸收峰位置的显著差异,氢化珊瑚钙的特征吸收峰为427 nm,与同为活性释氢物质的氢化钙具有一定的相似性,初步证明了所制备的氢化珊瑚钙具有一定释氢效果。

2.2 氢化珊瑚钙在不同温度的紫外可见光谱与自由基清除实验

以DPPH为对照,进行氢化珊瑚钙的氢缓释、自由基清除与抗氧化性能评价[11-12],测定氢化珊瑚钙在不同温度的紫外可见光谱见图2。

λ/nm图2 氢化珊瑚钙在不同温度时的紫外-可见光谱

由图2可知,t=30、35、40 ℃,氢化珊瑚钙的紫外可见光谱与对照组DPPH无明显差别,说明该温度范围内氢化珊瑚钙对自由基无明显清除作用,氢化珊瑚钙的释氢性能较弱。t=45 ℃,氢化珊瑚钙的谱线出现与对照组的显著差别,说明氢化珊瑚钙的有效释氢温度约为45 ℃,此时,氢化珊瑚钙能够实现有效释氢,表现抗氧化性与自由基清除效果。

2.3 氢化珊瑚钙的储氢含量研究与氢缓释性能评价

测定25～800 ℃氢化珊瑚钙的热失重曲线见图3。

t/℃图3 氢化珊瑚钙的热失重分析

由图3可知,氢化珊瑚钙的释氢失重段处于33.75～48.93 ℃,其w(储氢)≈0.02%。50～600 ℃再无其他失重,t>600 ℃,珊瑚钙骨架坍塌。

2.4 氢化珊瑚钙的细胞毒性评价

对氢化珊瑚钙的体外细胞毒性进行检测,评价不同ρ(氢化珊瑚钙)对体外HepG2细胞的24 h细胞毒性见图4。

ρ(氢化珊瑚钙)/(μg·mL-1)图4 ρ(氢化珊瑚钙)对HepG2细胞的24 h细胞毒性

由图4可知,在梯度质量浓度下(1 000、500、250、125、62.5、31.25 μg/mL),所制备的氢化珊瑚钙对体外HepG2细胞的增殖抑制作用不显著,最大质量浓度下细胞存活率显著高于90%,说明经天然珊瑚钙修饰得到的氢化珊瑚钙具有低毒性,对体外HepG2细胞毒性较低。

3 结 论

作者进行天然珊瑚钙微孔结构的储氢实验,制备得到氢化珊瑚钙,进一步进行氢化珊瑚钙的光谱性能分析,分析其有效释氢温度与储氢含量,并考察了氢化珊瑚钙的抗氧化性与自由基清除效果。实验结果显示,一方面,氢化珊瑚钙表现与活性释氢物质氢化钙相似的光学吸收,具有一定释氢效果,其释氢失重段处于33.75～48.93 ℃,w(储氢)≈0.02%;另一方面,氢化珊瑚钙在不同温度的紫外可见光谱与自由基清除实验,也验证了其有效释氢温度约为45 ℃,与热失重分析结论基本一致。此外,氢化珊瑚钙对体外HepG2细胞表现低毒性,说明经天然珊瑚钙修饰得到的氢化珊瑚钙是一种生物友好的微孔释氢与抗氧化材料,对于活性氢的抗氧化功效与机制分析、机体抗衰老等相关研究具有重要意义。