白芸豆中α-淀粉酶抑制剂活性的测定*

张雪娇,刘春叶,成 昭

(西安医学院 药学院,陕西 西安 710021)

α-淀粉酶抑制剂(α-AI)属于糖苷水解酶,是一种糖苷酶抑制剂,在禾谷类作物和豆类作物的种子中含量较为丰富[1]。近年的研究发现,糖尿病患者长时间的高血糖是导致病人多系统多脏器损害的最主要原因[2-4]。α-AI不但能特异性抑制α-淀粉酶活性,如胃肠道内唾液淀粉酶和胰淀粉酶等,使人体对糖分的吸收受到阻碍或延缓。同时,α-AI还可减少人体内糖向脂肪的转化,用来防治糖尿病、动脉硬化症、高血脂、脂肪过多症及肥胖症[5],在医学上有很好的应用发展前景。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

碘化钾、碘、磷酸二氢钠：天津市科密欧化学试剂有限公司;柠檬酸：无锡第二制药厂;氯化铜：北京市东风化学试剂有限公司;可溶性淀粉：天津市风船化学试剂有限公司;α-淀粉酶：邢台万达生物化学试剂有限公司;以上试剂均为分析纯;盐酸：优级纯,开封东大化工(集团)有限公司;α-淀粉酶抑制剂：自制,从白芸豆中提取;实验用水为蒸馏水。

紫外-可见分光光度计：UV-757,上海尤尼柯有限公司;电子天平：ALC-210.4,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司; 离心机：AnkeTGL-16C,上海安亭仪器厂;酸度计：PB-10,德国Accula公司;电热恒温水浴锅：DZKW-6-9,北京市永光明医疗厂。

1.2 实验方法

1.2.1ρ(淀粉)的确定

配制一定质量浓度的碘溶液、淀粉溶液和碘-淀粉复合物溶液,分别以相应溶剂为试剂空白,测定其吸光度,确定碘-淀粉复合物的最大吸收波长。

淀粉溶液：精密称取一定量烘干之后的可溶性淀粉,以缓冲溶液为溶剂配制ρ(淀粉)=0.001～0.008 g/mL溶液。碘液：参考文献[8],精密称取一定质量的碘化钾和碘,以蒸馏水为溶剂配制而成。缓冲溶液：在pH 计调控下,用0.2 mol/L的磷酸氢二钠溶液和0.1 mol/L的柠檬酸溶液配制pH =6.5的缓冲溶液。酶解反应终止液：参考文献[8]中的配制方法,精密称取一定质量的氯化铜和一定体积的质量分数37% 盐酸,用蒸馏水稀释配制而成。

上述淀粉溶液分别移取5.00 mL置于8只比色管中,t=37 ℃水浴锅中恒温10 min,依次加入同样在37 ℃水浴锅中恒温10 min的缓冲溶液和反应终止液各1.00 mL,摇匀,放至室温后,精确移取0.20 mL混合溶液于干燥试管中,再分别加入7.00 mL的碘液,充分混匀后在最大吸收波长处测定吸光度,根据不同质量浓度淀粉水解后吸光度的值确定实验所需淀粉的最佳质量浓度。

1.2.2 α-淀粉酶加入量的确定

为了考察α-AI对α-淀粉酶活性的抑制作用,实验中根据等量α-淀粉酶在不等量α-AI 的作用下对等量淀粉的水解促进作用不同,借助碘比色法确定不同条件下吸光度的变化,进而确定α-AI对α-淀粉酶活性的抑制效果。根据前期的实验结果[9],考虑到吸光度测量值和计算结果的准确性,实验采用5.00 mLρ(淀粉)=0.008 g/mL溶液、1.00 mLρ(α-淀粉酶)=0.03 mg/mL溶液。

1.2.3 α-AI抑制活性的测定

α-AI的制备：参考文献[10]中的方法,称取适量的白芸豆干燥粉末于蒸馏烧瓶中,加入去离子水,调整 pH 值和温度后浸提一段时间,离心、过滤上清液得 α-AI 粗提液。粗提液在酸性条件下进行沉降,取上清液用碱中和后通过醇沉法得到初步纯化的 α-AI。最后经超滤、透析及浓缩冻干后得到纯化的 α-AI。

样品管：在一系列试管中分别加入1.00 mLρ(α-淀粉酶)=0.03 mg/mL溶液,再分别加入1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mLρ(α-AI)=0.03 mg/mL溶液,用缓冲溶液定容至10.00 mL,摇匀后各取1.00 mL置于编号为1～6的样品管中;标准管 1：用缓冲溶液代替 α-淀粉酶溶液和α-AI,其他条件同上;标准管2：用缓冲溶液代替α-AI,其他条件同上。将所有试管置于37 ℃ 水浴加热2 min,依次加入同温度预热的5.00 mLρ(淀粉)=0.008 g/mL溶液,立即混匀。37 ℃准确反应10 min,立即加入1.00 mL的终止液。摇匀后冷却至室温,参考1.2.1方法取样与碘液充分显色,在最大吸收处测定其吸光度,根据样品管、标准管1及标准管2的吸光度值确定α-AI 对α-淀粉酶的活性抑制率。

α-AI对α-淀粉酶的活性抑制率参照文献[11]的方法,计算方法见公式(1)。

(1)

式中：As、Ab1、Ab2分别为样品管、标准管1和标准管2的吸光度值。

1.2.4 方法学考察

对实验中所建立起来的关于 α-AI抑制 α-淀粉酶活性的测定方法进行方法学考察。稳定性实验：随机抽取3号样为检测对象,在上述实验条件下测定其吸光度,间隔10 min测定1次,连续测定6次,根据测定结果计算RSD值。精密度实验：以3号样为检测对象,同时配制6份3号样品溶液,在上述实验条件下测定其吸光度,根据6次的测定结果计算RSD值。重现性实验：以3号样为检测对象,每天配制1份3号样品溶液,在上述实验条件下测定其吸光度,连续测定6次,根据测定结果计算RSD值。

2 结果与讨论

2.1 ρ(淀粉)的测定

碘溶液、淀粉溶液和碘-淀粉络合物溶液在可见光区的扫描结果见图1。

λ/nm图1 碘-淀粉络合物的紫外可见吸收曲线

由图1可知,碘-淀粉络合物在580 nm处产生明显的特征吸收。所以选择580 nm作为测定波长。

按照1.2.1方法进行操作,以ρ(淀粉)为横坐标,以吸光度为纵坐标,进行线性拟合,见图2。

ρ(淀粉)/(g·mL-1)图2 ρ(淀粉)与吸光度的关系

由图2可知,碘与淀粉络合后在580 nm处产生特征吸收,并且在一定质量浓度范围内,该特征吸收与ρ(淀粉)呈正相关性,该法可用于测定淀粉含量。

2.2 α-AI抑制活性的测定

2.2.1 α-AI抑制活性的测定

按照1.2.3方法进行操作,并按照公式(1)计算α-AI对α-淀粉酶的活性抑制率,将α-AI的加入量与α-AI的抑制活性进行线性拟合,见图3。

ρ(α-AI)/(mg·mL-1)图3 ρ(α-AI)对抑制率的变化曲线

由图3可知,ρ(α-AI)=0.003～0.018 mg/mL,对α-淀粉酶的活性抑制作用与ρ(α-AI)呈正相关性,可以利用碘与淀粉的显色反应对α-AI的抑制活性进行测定。

2.2.2 方法学考察

按照1.2.4方法随机抽取3号样为检测对象,分别对实验结果的稳定性、精密度及重现性进行考察,结果见表1。

表1 测定结果的稳定性、精密度和重现性 n=6

由表1可知,采用碘比色法测定α-AI抑制活性,t<1 h,RSD=1.86%,稳定性良好。精密度和重现性实验结果的RSD值分别为1.45%和2.10%,均小于5%。说明采用实验方法对α-AI抑制活性进行测定,结果准确,方法可靠。

3 结 论

(1)碘比色法测定α-AI对α-淀粉酶抑制率,实验条件为在pH =6.5的缓冲体系中,等量淀粉和等量淀粉酶的混合溶液中加入不等量α-AI,显色后根据其在580 nm处的测定结果计算α-AI对α-淀粉酶的活性抑制率,ρ(α-AI)=0.003～0.018 mg/mL,α-AI对α-淀粉酶的抑制率与ρ(α-AI)呈正相关性,线性相关系数r2=0.990 5。

(2)稳定性、精密度及重现性的实验结果表明,该实验方法在1h内稳定性良好,精密度和重现性的RSD值也均小于5%,说明结果准确可靠。

(3)实验条件易于控制、操作简单,为α-AI抑制α-淀粉酶活性强弱的研究提供可借鉴的参考依据。