鞘内注射大黄素纳米乳对骨癌痛大鼠的影响*

付时琛,吴 娜,谭 洁,罗斌华,任 平

(1.湖北科技学院医学部药学院,湖北 咸宁 437100;2.武汉轻工大学医学与健康学院)

转移性癌症诱发的骨痛是一种慢性疼痛,具有独特而复杂的病理生理学特征。世卫组织指南推荐使用非阿片类药物-弱阿片类药物-强效阿片类药物的阶梯式方法来缓解疼痛[1],但效果有限或副作用难以忍受。如何有效缓解患者的疼痛仍然是一个巨大的挑战,因此,积极探索骨癌痛发生发展的分子机制,寻找新的有效低毒药物有着重要的现实意义。大黄素(3-甲基-1,6,8-trihydroxyanthraquinone)分离自天然存在的蒽醌衍生物大黄,具有抗感受伤害、抗炎、抗微生物生长、免疫抑制、抗肿瘤等作用[2-3]。有报道称,大黄素可以通过抑制中枢神经系统的炎症过程来减轻疼痛[4]。但是大黄素是否对骨转移性疼痛大鼠起作用尚未有报道。因此,本研究在构建骨癌痛模型的基础上,探讨大黄素对骨癌痛大鼠的镇痛效应及其可能的作用机制,为骨癌痛新药的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要药品与试剂

RPMI-1640培养基、胎牛血清、DMSO溶液和胰蛋白酶(美国Gibco公司);大黄素,纯度≥98%(Aladdin);GFAP抗体(ABclonal)。

1.2 主要仪器

Von Frey纤维丝痛阈测试包(美国stoelting公司);多功能酶标仪(Bio Tek);二氧化碳(CO2)培养箱(德国Binder公司);电子天平(上海精密科学仪器有限公司)。

1.3 细胞

MRMT-1大鼠乳腺癌细胞培养于含有10%胎牛血清和100U/mL青霉素及100U/mL链霉素的RPMI-1640培养基中,置于37℃、5%CO2条件下培养。

1.4 实验动物

雌性SD大鼠,体质量180～200g,购自湖北贝恩特生物科技有限公司,许可证号:SCXK(鄂)2021-0027,实验动物均饲养于标准塑料饲养笼中,室温22℃～25℃,饲养环境通风,自由摄食饮水,保证12h/12h正常节律。

1.5 实验方法

1.5.1 大鼠骨癌痛模型的建立

大鼠骨癌痛模型的建立采用经典方法[5],大鼠10%水合氯醛(3mL/kg)麻醉后,仰卧固定于鼠台上,左后肢脱毛,暴露胫骨骨面,1mL注射器在骨面上打孔,后换用10μL微量注射器,在胫骨骨髓腔中缓慢注入10μL MRMT-1大鼠乳腺癌细胞(约3×105个),假手术组大鼠胫骨注射等体积生理盐水,无菌骨蜡封住针孔,75%酒精消灭溢出的肿瘤细胞,逐层缝合皮肤,消毒后涂抹青霉素粉末预防感染。术前、术后第3、6、9、12、14d检测并记录大鼠的机械缩足反射阈值。

1.5.2 大黄素纳米乳的制备

采用超声乳化法制备大黄素纳米乳。精确称取大黄素10mg,加入0.4mL大豆油,再加入0.4mL吐温80和0.2mL甘油,超声10min使其混合均匀。将装有3mL蒸馏水的烧杯置于细胞超声破碎仪探头下,设定功率为30%(195W)、工作时间5min。在超声的过程中,含药溶液用胶头滴管逐滴滴加到水相中,形成大黄素纳米乳。

1.5.3 分组与给药

将SD大鼠随机分为假手术组、模型组和大黄素组,每组6只。术后14d行为学测定结束后,大黄素组单次鞘内注射大黄素纳米乳(5mg/mL),每只10μL,大鼠出现甩尾行为表明注射成功,假手术组和模型组分别鞘内注射等体积生理盐水。注射后0、1、2、3、4h检测行为学变化。

1.5.4 检测各组大鼠胫骨病理学改变

术后第14d,取假手术组和模型组大鼠,10%水合氯醛麻醉后仰卧位固定,X光机拍摄各组大鼠胫骨X线片,观察胫骨病理学改变。

1.5.5 观察各组大鼠骨组织病理学变化情况

术后14d最后一次行为学检测结束后,取假手术组和模型组大鼠术侧胫骨标本,4%多聚甲醛溶液固定过夜,10%EDTA溶液脱钙21d后,石蜡包埋、切片进行HE染色。光学显微镜下观察组织病理学变化情况。

1.5.6 大鼠机械痛行为检测

测定前将各组大鼠置于四周透明、底部镂空的有机玻璃盒中30min使之适应,采用Up and Down法[6],用Von Frey纤维丝自上而下刺激各组大鼠左后足足趾底部中心,观察大鼠缩足反应,记录此时对应的折力值(g),即机械缩足反射阈值。实验需同一人操作,保证刺激强度一致,每只大鼠重复3次,取平均值。

1.5.7 检测大鼠脊髓GFAP的表达分布

处死大鼠后,取大鼠L4-L6损伤侧脊髓,4%多聚甲醛灌注后,进行冰冻切片,充分漂洗。加入GFAP(1∶500)一抗,室温孵育1h,4℃过夜;第2d漂洗后,加入对应荧光二抗,避光孵育2h,封片,荧光显微镜下观察拍照。

1.5.8 检测大鼠脊髓GFAP蛋白表达

最后一次行为学测定结束后,麻醉处死各组大鼠,冰上取大鼠L4-L6损伤侧脊髓,加入裂解液,匀浆后提取总蛋白,BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量,进行SDS-PAGE凝胶电泳,转膜封闭后,加入GFAP、GAPDH抗体,4℃孵育过夜,TBST洗涤3次,每次10min,加入二抗室温孵育1h,TBST洗涤3次,每次10min。对应条带加入ECL化学发光液,曝光成像,GAPDH为内参,Image J软件对条带进行分析。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 大鼠骨癌痛模型的鉴定

X线片显示,与假手术组大鼠相比,模型组大鼠胫骨可见明显的骨质破坏,骨密度不均匀,组织周围出现明显肿胀。HE染色显示,与假手术组相比,模型组大鼠胫骨骨小梁及骨髓腔内充满肿瘤细胞,出现骨质破坏,提示骨癌痛模型建立成功。见图1。

A:假手术组X线影像;B:模型组X线影像;C:假手术组HE染色;D:模型组HE染色图1 假手术组和模型组大鼠胫骨X线影像和HE染色结果(HE×100)

2.2 大鼠机械缩足反射阈值的检测结果

各组大鼠术前机械缩足阈值(PWT)无明显差异(P<0.05);造模后7～14d,与假手术组相比,模型组和大黄素组大鼠PWT值均显著降低(P<0.05)。见表1。在大黄素纳米乳治疗前,模型组与大黄素组PWT值无明显差异(P>0.05),在治疗后的1、2、3h,大黄素组的PWT值均显著升高(P<0.05),4h降低至接近注射前水平。见表2。

表1 各组大鼠造模后0-14d术侧后爪PWT值比较

表2 纳米大黄素治疗后各组大鼠术侧后爪PWT值比较

2.3 大鼠脊髓背角神经元活动的结果

采用免疫荧光检测各组大鼠L4-L6腰段脊髓中GFAP表达情况,如图2显示,与假手术组相比,模型组大鼠脊髓中GFAP的表达明显增强;与模型组相比,大黄素组大鼠脊髓中GFAP的表达量显著下降,提示鞘内注射大黄素纳米乳可以显著抑制骨癌痛大鼠脊髓背角GFAP的表达。

图2 鞘内注射大黄素纳米乳对骨癌痛大鼠脊髓背角GFAP(红色)表达的影响(n=3,标尺=100μm)

2.4 大黄素纳米乳对大鼠脊髓中GFAP蛋白表达的影响

与假手术组相比,模型组大鼠脊髓中GFAP蛋白表达量明显增加(P<0.01);与模型组比较,大黄素组大鼠脊髓中GFAP蛋白表达量明显降低(P<0.01)。见图3。

与假手术组比较,*P<0.01;与模型组比较,#P<0.01,n=3图3 鞘内注射大黄素纳米乳对骨癌痛大鼠脊髓中GFAP蛋白表达的影响

3 讨 论

骨骼系统是癌症转移的第三大常见部位,仅次于肺和肝,许多肿瘤,尤其是乳腺、前列腺、肺和肾的肿瘤都有很强的骨转移倾向。据统计,70%的患者在疾病诊断时会发生骨病理改变,这会导致疼痛、高血钙症、病理性骨折、脊髓或其他神经结构受到压迫、活动能力下降,从而增加死亡率[7]。中药对急性或慢性疼痛均能起到一定的镇痛作用,其低成瘾性和较少的副作用有望成为新的镇痛选择。因此,探究骨癌痛的作用机制,寻找高效安全的药物改善患者生活质量是很有必要的[8]。本研究通过在大鼠胫骨骨髓腔中注入MRMT-1大鼠乳腺癌细胞,结果显示,模型组大鼠机械痛阈值较假手术组明显降低,且HE染色发现胫骨发生癌细胞浸润,提示骨癌痛模型建模成功。进一步注射大黄素纳米乳发现,大黄素组大鼠机械痛阈值在一定时间内明显升高,几小时后痛阈值降低至初始疼痛水平,大黄素完全耐受,说明大黄素纳米乳可以短期改善大鼠骨癌痛。

神经胶质细胞简称胶质细胞,是神经组织中除神经元以外的另一大类细胞,在神经免疫、神经元信号传递的调控等方面起着不可或缺的作用,与中枢敏化的产生和疼痛密切相关[9]。在脊髓水平上,激活的星形胶质细胞会释放多种促炎因子,例如TNF-α、IL-1β、TGF等,这些促炎细胞因子会导致更多神经递质的释放,从而促进疼痛信号在中枢的传递,激活疼痛[10]。在骨癌痛等慢性疼痛中,TNF-α、IL-1β水平升高。胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是星形胶质细胞活化的标志物[11],GFAP表达的增加,引起转录后修饰,导致脊髓促炎物质增加神经的兴奋性,加重疼痛反应。本研究结果显示,模型组大鼠脊髓星形胶质细胞标记蛋白GFAP表达上调,给予大黄素纳米乳治疗后,GFAP的表达明显被抑制,这表明大黄素纳米乳可能通过抑制星形胶质细胞的激活,从而缓解大鼠骨癌痛,为骨癌痛新药的开发提供理论依据。