基于生信分析阿那曲唑治疗ER+乳腺癌的临床意义*

叶晓娟,吴 喆,林 丽**

(1.武汉市江岸区妇幼保健院,湖北 武汉 430014;2.湖北科技学院基础医学院)

乳腺癌(BRCA)是女性最常见的恶性肿瘤之一,约占全球所有癌症病例的23.1%,死亡人数的11.6%[1]。越来越多的研究证实[2-4],雌激素在BRCA发病机制中起重要作用,绝经后妇女雌激素水平异常升高,会增加患BRCA的风险,抑制雌激素的表达可以有效控制BRCA的发生、发展和转移。

阿那曲唑是一种非甾体芳香化酶抑制剂,适用于晚期乳腺癌绝经后妇女,同时也适用于绝经后妇女雌激素受体阳性的早期乳腺癌的辅助治疗。对雌激素受体阴性的患者,如果对他莫昔芬呈现阳性的临床反应,仍可以考虑使用阿那曲唑[5]。Forbes等[6]的双盲随机对照试验结果表明,阿那曲唑辅助治疗激素受体阳性早期BRCA绝经后妇女的临床疗效与他莫昔芬一样,患者耐受性也较好。

生物信息学分析为减少冗余的实验提供了方便和有用的方法,利用肿瘤基因图谱(cancer genome atlas,TCGA)等大数据,借助现有的药物信息来预测癌症中可能的基因表达变化以及发掘新的治疗/诊断生物标记物是势在必行的[7-8]。因此,本研究通过cBioPortal、GSCALite和UALCAN等生物信息学工具分析阿那曲唑的靶基因及其临床意义,为阿那曲唑甚至其他抗肿瘤药物的作用靶点和机制提供参考。

1 资料与方法

1.1 阿那曲唑的药物作用靶基因分析

基于Drugbank数据库(https://www.drugbank.ca),筛查阿那曲唑的分子信息,并识别其药物作用靶基因。

1.2 阿那曲唑靶基因的关联基因分析

基于cBioPortal数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/),选择“TCGA-BRCA”进行基因集分析,鉴定与阿那曲唑靶显著关联的基因。

1.3 阿那曲唑靶基因的作用网络及富集通路分析

基于GSCALite数据库(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/ web/GSCALite/#shiny-tab-drug),分析阿那曲唑靶基因的作用网络及富集通路。

1.4 阿那曲唑靶基因的生存分析

通过cBioPortal数据库(http://www.cbioportal.org)分析TCGA数据库(https://tcga-data.nci.nih.gov)中乳腺浸润性癌996例,数据的使用符合TCGA的出版要求。按CYP19A1基因突变情况,将996例病例资料分为两组,收集诊断中位年龄、性别、肿瘤分期等临床信息。基于UALCAN数据库(http://ualcan.path.uab.edu),分析从TCGA数据库中获得的人BRCA中阿那曲唑靶基因的基因组数据,并应用Kaplan-Meier(KM)曲线进行生存分析。

1.5 阿那曲唑靶基因在不同组织的蛋白表达图谱

基于TCGA和人类蛋白图谱(human protein atlas,HPA)的数据,获得CYP19A1蛋白在肿瘤组织/器官中的表达情况。

1.6 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析,生存分析采用KM曲线和Log-rank检验法,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 阿那曲唑的直接作用靶基因

Drugbank数据库显示,阿那曲唑是一种小分子芳香化酶抑制剂类药物,只有一个作用靶基因CYP19A1,它是芳香化酶的编码基因,其功能是作为芳香化酶抑制剂。

2.2 CYP19A1及其相关基因的表达、作用网络及富集通路分析结果

BRCA病例样本中与CYP19A1直接相关的前5个基因,依次是FGF7(r=0.49)、MMRN1(r=0.40)、LYVE1(r=0.37)、HBS1L(r=0.34)和DGAT2(r=0.34)。mRNA表达分析结果表明,CYP19A1、HBS1L基因在正常组织中高表达,在肿瘤组织中低表达(图1)。拷贝数变异(copy number variants,CNV)分析结果表明,BRCA中上述基因的主要突变类型为杂合扩增(heterozygous amplification)和杂合缺失(heterozygous deletion),杂合缺失比杂合扩增更易引起基因变异(图2B);从图2C可以看出,与其他基因相比,HBS1L基因表达水平与CNV改变的关联更显著。图3是这些基因的通路富集结果,分别显示了它们在涉及最显著的凋亡、细胞周期、激素AR等重要通路中的表达差异。图4是预测得到的这些基因相关的miRNA网络,点的大小代表与之有关联的显著性功能的数量多少,点越大,代表与之有关联的显著性功能数量越多,推测其越重要,是网络中核心的miRNA,可作为验证实验对象以及进一步的分析。

A:肿瘤与正常差异表达;B:亚型。圆的大小表示FDR值,圆的颜色显示log2 FC,值越大、颜色越深图1 mRNA表达

A:CNV百分率图谱,HETE Amp(浅红色)代表杂合扩增;HETE Del(浅绿色)代表杂合缺失;Homo Amp(深红色)代表纯合扩增;Homo Del(深绿色)代表纯合缺失;None(灰色)代表无CNV;B:CNV杂合点图谱,蓝色代表CNV缺失,红色代表CNV扩增,点越大突变率越大;C:CNV与mRNA的Pearson相关性RSEM,蓝色代表正相关,红色代表负相关,颜色越深相关性越强,斑点越大越显著图2 拷贝数变化

图4 miRNA网络(节点的大小与节点的度呈正相关)

2.3 BRCA中CYP19A1的表达及生存分析结果

阿那曲唑靶基因CYP19A1与BRCA之间的关系见表1、图5～6。表1显示了1978—2020年996例乳腺浸润性癌患者的临床特征,CYP19A1突变组(12例)、未突变组(984例)的中位总生存期分别为17.99月、27.52月(P=0.331)。图5显示了CYP19A1基因在乳腺肿瘤样本与正常样本中的相对表达,且在不同组织(正常或肿瘤)、癌症分期、患者年龄、癌症亚类和更年期状态的表达均有显著差异(P均<0.05)。生存分析结果表明,CYP19A1高表达组总生存期短于低表达组和中等表达组(P=0.62),见图6A;CYP19A1表达水平对不同绝经状况BRCA患者的生存具有显著影响(P=0.016),见图6B。

表1 TCGA数据中996例BRCA患者临床特征

A:显示CYP19A1在正常和BRCA样本中相对表达;B:根据个体的癌症分期显示CYP19A1在BRCA中的相对表达;C:根据患者年龄显示CYP19A1在BRCA中的相对表达;D:显示CYP19A1在正常、luminal、HER2阳性和三阴性BRCA患者中的相对表达;E:显示CYP19A1在正常、绝经前、围绝经期和绝经后患者中的相对表达图5 CYP19A1在BRCA病例样本中的相对表达

A:CYP19A1表达水平对BRCA患者生存的影响;B:CYP19A1表达水平对不同绝经状况BRCA患者生存的影响图6 Kaplan-Meier曲线图显示CYP19A1表达与患者存活率的关系

2.4 CYP19A1蛋白在各器官的表达结果

阿那曲唑靶基因CYP19A1蛋白在正常和肿瘤组织/器官中的表达情况见图7。结果显示,CYP19A1在ER+BRCA患者胎盘滋养层细胞质/膜高表达;413例女性胎盘中高表达CYP19A1的滋养层细胞可高达45%。

A:30岁女性BRCA患者(编号:2515)胎盘滋养层细胞CYP19A1表达;B:31岁女性BRCA患者(编号:337)胎盘滋养层细胞CYP19A1表达图7 CYP19A1蛋白在正常和肿瘤组织/器官中的表达结果

3 讨 论

阿那曲唑是第三代芳香化酶抑制剂类药物。体内外研究均显示[5,9-10],阿那曲唑能有效抑制雄激素向雌激素转化;而绝经后妇女的雌激素主要来源于雄激素前体物质在外周组织的芳香化,由于阿那曲唑选择性较高,不影响糖皮质激素、盐皮质激素和甲状腺功能,其大剂量使用对肾上腺皮质类固醇类物质的分泌无抑制作用,故该类药物特别适用于绝经后的乳腺癌患者。雌激素浓度是BRCA的关键危险因素,这种联系的机制尚不清楚;有学者认为其中一些变体可能会改变芳香化酶的表达和/或活性。CYP19A1是芳香化酶的编码基因,芳香化酶是雌激素合成过程中的一个关键酶,芳香化酶抑制剂类药物通过抑制芳香化酶,使雌激素水平下降,从而消除雌激素对肿瘤生长的刺激作用[11]。其他临床研究证实CYP19A1的基因多态性对阿那曲唑治疗乳腺癌有着重要的影响[12];本研究基于生物信息学分析了CYP19A1在不同组织(正常或肿瘤)、癌症分期、患者年龄、癌症亚类和绝经状况的差异表达,结果表明,阿那曲唑靶基因CYP19A1表达水平与ER+BRCA患者的生存具有显著相关(P<0.05)。

CYP19A基因位于染色体15q21.1上,编码细胞色素P450超家族成员,催化雌激素生物合成的最后一步,即雄激素A环的连续三次羟基化。癌症基因组图谱(TCGA)项目的基因组学数据促进了多种肿瘤的基因差异表达和生存关联的研究。本研究通过公共数据库发现并分析了阿那曲唑潜在抑制乳腺癌的靶基因CYP19A1,筛选出5个CYP19A1最重要的关联基因(FGF7、MMRN1、LYVE1、HBS1L和DGAT2),将基因表达数据与特定基因拷贝数变异(CNV)结合分析,可以进一步提供这些基因在功能研究中的相关生物学信息。众所周知,大多数肿瘤不是由单个基因的单一突变引起的,研究CYP19A1基因的关联基因表达情况,有助于更精准的进行肿瘤分型与治疗。例如,在本研究中,mRNA表达分析结果表明,CYP19A1、HBS1L基因在正常组织中高表达,在肿瘤组织中低表达。此外,拷贝数变异(CNV)是由基因组发生重排而导致的,是人类疾病的重要致病因素之一。研究表明[13],CYP19A1扩增导致芳香酶活性增加和雌激素非依赖性ERα与靶基因的结合,导致CYP19A1 amp(扩增)细胞对AI治疗的敏感性降低。在本研究中,CNV分析结果表明,乳腺癌中上述基因的主要突变类型为杂合扩增和杂合缺失,杂合缺失比杂合扩增更易引起基因变异;与其他基因相比,HBS1L基因表达水平与乳腺癌CNV改变的关联更显著。此外,通路富集结果显示上述基因涉及重要的通路包括凋亡、细胞周期、激素受体等,进一步揭示了CYP19A1基因畸变(或表达)如何参与BRCA亚型患者生存的发病机制。在肿瘤发生过程中,miRNA可以通过自身的上调和下调分别行使原癌基因和抑癌基因的作用;miRNA也可影响肿瘤细胞对于细胞抑制剂的敏感性。上皮间充质转化中miRNA的复杂调节可以通过miR-200家族(miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141及miR-429)实现[14]。通过本研究预测,miR-200、miR-300、miR-500家族涉及CYP19A1及相关基因的miRNA调控网络,值得进一步研究。

识别BRCA亚型的特异性生物标志物是非常重要的。在UALCAN数据库中,TCGA-BRCA肿瘤亚类分为Luminal型、HER2阳性型以及三阴性型,特定基因CYP19A1的表达水平在这些组中分别显示。本研究通过比较TCGA数据库中996例CYP19A1突变组、CYP19A1未突变组的转录组数据,结果表明,CYP19A1在Luminal型、HER2阳性或三阴性乳腺癌中的表达存在显著差异,提示绝经后乳腺癌患者样本中CYP19A1的表达可能比绝经前患者更高。此外,其他生物信息学分析结果表明[15],CYP19A1基因的遗传多态性与绝经后妇女芳香化酶活性和循环类固醇激素水平有关。候选基因研究[16]发现,绝经前和绝经后女性以及男性的雌激素水平与CYP19A1的基因变异有关。Friesenhengst等[17]分析了138例BRCA患者和15个乳腺癌细胞系肿瘤内CYP19A1 mRNA的表达,发现在ER+BRCA患者中,CYP19A1的高表达与总生存率(OS)、无病生存率(DFS)、无转移生存率(MFS)密切相关,与本实验结果一致。此外,CYP19A1 mRNA在绝经后和50岁以上患者中均显著升高,且与ER类型和ESR1mRNA表达呈正相关。其他证据显示[18],CYP19A1基因表达水平的改变可能与疾病的病理临床因素、OS、DFS、MFS、代谢功能标志物、卵泡刺激素(FSH)浓度以及BRCA中CYP19A1基因的多个外显子有关。这些研究结果突出了CYP19A1作为芳香化酶在ER+BRCA生物学中的关键作用。

综上所述,本研究应用cBioPortal、GSCALite和UALCAN等生物信息学工具分析了阿那曲唑的靶基因CYP19A1及其临床意义,初步构建了药物-作用靶基因的关联分析方法,为分析阿那曲唑甚至其他抗肿瘤药物的作用靶点和作用机制提供参考。