MuRF2、PPAR γ1 和Ub 重组质粒的构建及鉴定

范玉成，徐方晶，王 锐，何 军，3，景 丽

（1.宁夏医科大学基础医学院，银川 750004；2.宁夏医科大学临床医学院，银川 750004；3.宁夏医科大学总医院，银川 750004；4.宁夏医科大学附属石嘴山市第一人民医院病理科，石嘴山 753000）

过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPAR γ）是核受体超家族中的重要一员[1-3]。噻唑烷酮类化合物以及布洛芬、芬布芬等非甾体抗炎药物是PPAR γ 重要的人工合成配体[4-5]。有研究[6-8]发现，糖尿病患者发生心肌代谢紊乱与PPAR γ 激活及表达增强有关。泛素连接酶肌肉环指状蛋白2（ubiquitin ligase muscle ring finger protein2，MuRF2）是近年发现的心肌横纹肌特异性泛素连接酶[9]。在心肌组织中，MuRF2 存在于心肌肌小节M线，与肌联蛋白、肌动蛋白和肌球蛋白协同完成心肌细胞收缩活动，参与并调控心脏发育和舒缩功能[10]。本课题组前期研究[11-12]发现，MuRF2 通过泛素化方式修饰PPAR γ1，其缺失可能导致严重的糖尿病心肌病，而糖尿病心肌病是目前糖尿病患者死亡的一种常见原因[13-15]。关于MuRF2 通过泛素化方式修饰PPAR γ1 参与糖尿病心肌病发生的机制尚不清楚，仍需通过适当的载体进行相关研究。本文旨在构建PPAR γ1、MuRF2 和泛素（ubiquitin，Ub）的重组质粒，以HEK 293T 细胞为工具细胞进行共转染，检测PPAR γ1、MuRF2 和Ub 蛋白的表达及泛素化修饰作用，以期为探讨PPAR γ1 和MuRF2 泛素化修饰作用提供载体。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

GV146 载体和GV417 载体购自上海吉凯基因化学技术有限公司；大肠杆菌感受态细胞DH5α 由本实验室制作保存；HEK 293T 细胞由武汉普诺赛生命科技有限公司提供；GeneRuler 1 kb DNA Ladder 购自Thermo Scientific 公司；NormalRunTM250 bp-ⅡDNA Ladder 购自GeneRay公司；Restriction Endonuclease 购自NEB 公司；HS DNA Polymerase 购自TaKaRa 公司；Taq Plus DNA polymerase 和ClonExpressTMⅡOne Step Cloning Kit 购自Vazyme 公司；EndoFree midi Plasmid Kit 购自北京天根公司；质粒提取试剂盒购自Omega 公司；LipofectamineTM3000 Reagent购自Invitrogen 公司；DMEM 培养基和胎牛血清购自Gibco 公司；PBS 和胰酶购自BI 公司；全蛋白检测试剂盒、BCA 蛋白含量检测试剂盒和SDS－PAGE 快速凝胶配制试剂盒购于凯基生物公司；PPAR γ 抗体购自Cell Signaling Technology 公司；GAPDH 抗体购自博奥森公司；辣根过氧化酶标记的二抗购自北京天根公司；免疫（共）沉淀（IP/CoIP）试剂盒购自爱必信公司；HA 抗体购自碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 载体酶切 配制50 μL 酶切反应体系，用100 μL 移液枪轻柔吹打混匀，置于37 ℃恒温箱中反应3 h。对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带。

1.2.2 引物设计与合成 根据PPAR γ1、MuRF2和Ub 的cDNA 克隆基因序列以及GV146 和GV417 载体上的多克隆位点，应用Premier 5.0软件设计目的基因扩增引物（表1）及菌落PCR鉴定引物（表2）。引物由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。

表1 目的基因扩增引物序列

表2 菌落PCR 鉴定引物序列

1.2.3 PCR 扩增目的基因片段 以合成引物进行PCR 反应，扩增Ub、MuRF2、PPAR γ1 全长基因。PCR 反应体系：5× Primer star buffer 10 μL，模板1 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，dNTP（10 mmol）1 μL，Prime star 0.5 μL，双蒸水补加至50 μL。PCR 扩增条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，从70 ℃开始，以0.5 ℃为阶梯逐渐降温，以65 ℃为退火温度，退火时间为30 s，72 ℃延伸1 min，共30 个循环；72 ℃再延伸10 min。PCR 产物经1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.4 PCR 产物与载体进行交换及转化 于冰水浴中配制反应体系。用100 μL 移液枪轻柔吹打混匀，避免产生气泡。于37 ℃反应30 min，随后置于冰水浴中冷却5 min 后立即转化。于100 μL 感受态细胞中加入10 μL 交换反应产物，轻弹管壁数下混匀，置于冰上30 min。42 ℃热激90 s，冰水浴孵育2 min。加入500 μL LB 培养基，置于37 ℃摇床振荡培养1 h。取适量菌液均匀涂布在含有卡那霉素的平板上，于37 ℃恒温培养箱中倒置培养16 h。

1.2.5 菌落PCR 鉴定及基因测序 配制20 μL PCR 鉴定反应体系，振荡混匀。在超净工作台中，用无菌的移液枪枪头挑取单个菌落至20 μL 鉴定体系中，吹打混匀，置于PCR 仪中进行反应。将鉴定出的阳性克隆转化子接种于含有卡那霉素的LB 液体培养基中，于37 ℃恒温箱中培养12～16 h，取适量菌液寄送至上海吉凯基因化学技术有限公司进行DNA 测序分析。对测序结果和目的基因序列进行比对分析确定重组质粒构建成功与否。

1.2.6 重组质粒转染 接种HEK 293T 细胞至6 孔板内（应尽量保证为单细胞悬液，且消化程度适合，处于良好的生长状态），接种细胞数量约为3×105至5×105细胞/孔，每孔加入2 mL DMEM完全培养基，置于37 ℃恒温箱中培养24 h。转染前需确保细胞密度适宜（汇合度应为70%～80%），状态良好。利用LipofectamineTM3000 Reagent 将MuRF2、PPAR γ1 和Ub 重组质粒共转染至HEK 293T 细胞。

1.2.7 胞内泛素化反应的Western blot 分析 收集细胞，用全蛋白提取试剂盒提取蛋白，并进行BCA 蛋白定量。取500 μg 蛋白加入HA 标签抗体5 μL 置于4°C 冰箱，旋转孵育过夜。加入5 μL Protein A 和5 μL Protein G，置于4 °C 冰箱，旋转孵育过夜后，12 000×g，4 ℃离心1 min，保留沉淀。500 μL 1× Wash buffer 清洗沉淀，12 000×g，4 ℃离心1 min，保留沉淀（去除上清时可使用1 mL 注射器，避免吸走沉淀）；重复此步3 次。加入30 μL 1× SDS 样品缓冲液中重悬沉淀物，涡旋振荡后，微量离心30 s，以使附着管壁的珠子和液体沉于管底；100 ℃金属浴15 min，14 000×g瞬时离心1 min，吸取上清液，样品用Western blot 检测分析。

1.3 统计学方法

数据的整理和分析采用SPSS 23.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用t 检验。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MuRF2 介导PPAR γ1 发生泛素化修饰

本课题组前期研究[12]提示，MuRF2 通过泛素化方式修饰PPAR γ1，图1 为自绘的该修饰反应的模拟图。MuRF2 上的多泛素链可作为“着陆垫（landing pads）”，通过Ub 和E2 上的UBD 之间的非共价相互作用来招募多个E2-Ub 分子。E2-Ub 分子的局部浓度增加允许MuRF2 发生渐进性泛素化。

图1 MuRF2 介导PPAR γ1 泛素化修饰模拟图

2.2 载体质粒酶切

GV146 载体和GV417 载体信息见图2。从细菌中提取的未酶切载体质粒因可能存在超螺旋、开环、线性等不同的构象而具有不同的迁移速率，在琼脂糖凝胶电泳中呈现大小不同的条带，载体质粒经酶切消化后呈现均一的电泳条带。GV146 载体由XhoI/EcoRI 酶切；GV417 载体由NheI/BamHI 酶切（图3）。

图2 载体质粒信息

图3 载体酶切图

2.3 目的基因克隆

以合成的PPAR γ1、Ub 和MuRF2 为引物，利用PCR 实验技术克隆目的基因片段。克隆产物经琼脂糖凝胶电泳检测，条带大小与预期结果一致（图4）。

图4 目的基因片段克隆

2.4 重组克隆的PCR 鉴定及基因测序

PPAR γ1、Ub 和MuRF2 的菌落PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析。空白对照以ddH2O为模板，用于检测鉴定体系是否存在污染；阴性对照以未插入目的基因的空载体为模板，用于证明扩增过程中无假阳性现象；阳性对照以含有GAPDH 基因的DNA 为模板，用于验证鉴定工作体系是否正常。PPAR γ1、MuRF2 和Ub 基因片段大小分别为943、1 154 和451 bp，均为阳性。取适量菌液送至上海吉凯基因化学技术有限公司进行测序，测序结果与目的基因序列进行比对分析。结果证实成功构建出PPAR γ1、MuRF2 和Ub 的重组质粒（图5、图6）。

图5 PCR 产物琼脂糖电泳图

图6 阳性克隆转化子测序峰图

2.5 Western blot 检测重组质粒蛋白表达及蛋白质的相互作用

在HEK 293T 细胞中共转染携带增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）和樱桃红荧光蛋白（Cherry）的重组质粒。A 组共转染Cherry-His-MuRF2、EGFP-PPAR γ1 重组质粒和空载质粒，B 组共转染Cherry-HA-Ub、EGFP-PPAR γ1 重组质粒和空载质粒，C 组共转染Cherry-His-MuRF2、Cherry-HA-Ub 和EGFPPPAR γ1 重组质粒。48 h 后于荧光显微镜下观察，3 组细胞均可见EGFP 和Cherry 荧光蛋白的表达，证明重组质粒成功转染HEK 293T 细胞（图7）。提取细胞总蛋白，进行免疫共沉淀实验，实验后Western blot 检测重组质粒蛋白表达（Input 组）及蛋白质间相互作用（IP 组）（图8），PPAR γ1、MuRF2 和Ub 蛋白有效表达，且验证了MuRF2 介导PPAR γ1 发生泛素化修饰反应。

图7 PPAR γ1、Ub 和MuRF2 重组质粒共转染HEK 293T 细胞（×100）

图8 Western blot 检测可见PPAR γ1、MuRF2 和Ub 蛋白表达

3 讨论

泛素化修饰作为一类关键的蛋白质翻译后修饰参与调控了一系列的生物过程，在人类生命活动中扮演着关键角色[16]。泛素化修饰是指Ub在一系列特定的酶作用下，将细胞中的蛋白分类，从中选择靶蛋白分子，Ub 末端甘氨酸的羧基端连接到底物蛋白的赖氨酸氨基形成异肽键，进而对靶蛋白进行特异性修饰的生物学过程[17-18]。Ub与蛋白质的结合会产生诸多方面影响，决定了被修饰蛋白的功能和命运，包括发送信号通过蛋白酶体降解靶蛋白，改变靶蛋白的细胞定位，影响靶蛋白的活性，促进和阻止蛋白相互作用等[19-23]。本课题组前期研究[12]发现，MuRF2 通过泛素化方式修饰PPAR γ1，其缺失可能导致严重的糖尿病心肌病，而该修饰作用的详细机制尚不清楚。

本研究选择GV146 和GV417 作为真核表达的克隆载体，根据PPAR γ1、MuRF2 和Ub 的cDNA 序列及载体质粒上的多克隆位点设计目的基因克隆引物。以合成的引物，利用PCR 实验技术克隆PPAR γ1、MuRF2 和Ub 的全长基因为目的DNA 片段。选择XhoI/EcoRI 内切酶双酶切PPAR γ1 目的DNA 与GV146 载体；选择NheI/BamHI 内切酶分别双酶切MuRF2 和Ub目的DNA 与GV417 载体。用连接酶连接双酶切后的目的DNA 和载体，导入大肠杆菌经行转化、抗性筛选、测序鉴定、质粒提取等过程成功获得重组质粒。以LipofectamineTM3000 介导瞬时转染HEK 293T 细胞，转染效果良好，目的蛋白表达明显，且验证了MuRF2 通过泛素化方式修饰PPAR γ1。PPAR γ1、MuRF2 和Ub 重组质粒的构建为更为深入探讨MuRF2 泛素化修饰PPAR γ1的详细机制提供了有效的研究基础。