基于代谢组学及肠道菌群探索运动性疲劳的发生机制

陈玉容，易东平

1.海南医学院体育部，海南海口 571199；2.重庆三峡学院体育学院，重庆 404199

运动性疲劳在体育学中较为常见，若未及时消除，会严重影响人体代谢，导致代谢组学发生变化，甚至诱发器质性病变，从而威胁身心健康[1]。研究指出，相较于正常群体，运动员这一群体的肠道菌群有所不同，加强对运动员肠道菌群的了解，可以更好地掌握运动员的身体状况，从而针对性地进行训练和饮食调节，对其运动成绩的提高有着十分积极的作用[2]。本研究为进一步了解运动性疲劳发生后，人体代谢组学及肠道菌群在其中发挥的作用情况，选取海南医学院2021年1月—年6月培养的24只雄性SD大鼠进行分组对照探究，旨在为临床提供有效的参考，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

①试剂药品：甲氧胺盐酸盐（批号5001E07X，规格：98%），BSTFA+1% TMCS（批号60196，规格：1 g）、硬脂酸甲酯（批号J22-A，规格：99.5%）、乙腈、吡啶、正庚烷等。

②仪器设备：聚焦显微镜（OLYMPUS FV1000S）、各类分子生物设备（型荧光定量PCR仪，ABIPrism7900）、图像分析系统（显微镜及Axioson分析软件，OLYMPUS BX500）、高效液相色谱、电泳及双向电泳装置、凝胶成像系统、高速冷冻离心机、超低温冰箱、紫外/可见分光光度计、全自动台式灭菌仪、无菌室和超净工作台。

③动物模型制备：海南医学院培养雄性SD大鼠24只，体质量100~150 g，经随机数表法分为空白组和运动组，各12只。空白组平均体质量（123.21±12.36）g，运动组平均体质量（124.05±12.75）g。两组各项资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。对运动组进行递增负荷训练（炮台坡度0°），持续6 d，最后1 d为力竭训练，见表1。

表1 递增负荷训练表

1.2 方法

①检测指标：采集心尖部血液5 mL，将其保存至4℃冰箱待测。将心脏组织予以漂洗，置于4℃冰箱待测。检测血乳酸脱氢酶、肝糖原、肌糖原、肌酸激酶、血清尿素氮各疲劳指标，标本采集后离心处理分离血清并保存待检，本次检测的仪器设备为全自动生化分析仪（日立7600-020型）。

②样本采集：采集空白组与运动组样本，收集尿液50 mL，尿液样本采集后，迅速转移至-80℃保存；新鲜粪便样本，迅速转移至-80℃保存；新鲜全血样本，大鼠腹主动脉采血2~5 mL，收集于标记后的EDTA抗凝管中，采集后的血液保存至-80℃冰箱（实验中用到的为全血样本）。

③代谢组学分析：样本数量的筛选按照80%原则，内标实行归一化，得到可视化矩阵，这个矩阵包含有样品名、峰面积、m/z-RT对。正离子模式下共得到573个features，在负离子模式下共得到174个features。实施中心化及Pareto标度化，而后进行多元统计分析。

④菌群与代谢物相关性分析：采用spearman分析法对存在显著差异的代谢组学指标和肠道菌群进行相关性分析。

1.3 观察指标

比较两组疲劳指标[血乳酸脱氢酶（lactate dehy⁃drogenase, LD）、肝糖原、肌糖原、肌酸激酶（creatine kinase, CK）、血 清 尿 素 氮（serum urea nitrogen,BUN）]，尿液代谢物3-丁二醇、3-氨基异丁酸、柠檬酸、尿酸，粪便代谢物3-氨基异丁酸、戊糖醇、柠檬酸、D-葡萄糖酸、尿酸，以及大肠埃希菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、葡萄球菌各肠道菌群。比较代谢组学指标与肠道菌群的相关性。

1.4 统计方法

采用SPSS 21.0统计学软件处理数据，符合正态分布的计量资料以（±s）表示，组间差异比较采用t检验；计数资料以[n(%)]表示，组间差异比较采用χ2检验；相关性分析采用Pearson相关系数（r）表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠疲劳指标比较

运动组LD、肝糖原、肌糖原、CK、BUN水平均高于空白组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 两组大鼠疲劳指标比较(±s)

表1 两组大鼠疲劳指标比较(±s)

组别空白组（n=12）运动组（n=12）t值P值LD（U/L）212.32±26.78 458.97±54.60 14.050<0.001肝糖原（mmol/L）21.26±6.45 69.82±9.87 14.267<0.001肌糖原（mmol/L）15.68±3.64 38.97±6.21 11.208<0.001 CK（U/L）154.78±12.03 318.70±25.96 19.846<0.001 BUN（mmol/L）5.05±1.14 12.36±3.25 7.352<0.001

2.2 两组大鼠代谢组学指标比较

运动组尿液代谢物3-丁二醇、3-氨基异丁酸、柠檬酸、尿酸水平均高于空白组，差异有统计学意义（P<0.05）。运动组粪便代谢物3-氨基异丁酸、戊糖醇、柠檬酸、D-葡萄糖酸、尿酸均高于空白组，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

表2 两组大鼠代谢组学指标比较(±s)

表2 两组大鼠代谢组学指标比较(±s)

类型尿液粪便指标3-丁二醇3-氨基异丁酸柠檬酸尿酸3-氨基异丁酸戊糖醇柠檬酸D-葡萄糖酸尿酸空白组（n=12）5.46±0.87 7.59±1.61 12.30±3.87 15.68±3.14 6.52±0.94 6.02±1.54 11.63±2.98 4.12±0.54 14.19±2.37运动组（n=12）7.48±1.20 9.55±2.64 15.86±4.41 20.03±4.68 9.85±1.67 8.79±2.03 14.47±3.60 5.68±0.68 16.89±3.68 t值4.032 2.196 2.102 2.674 6.019 3.766 2.105 6.223 2.137 P值<0.001 0.039 0.047 0.014<0.001 0.001 0.047<0.001 0.044

2.3 两组大鼠肠道菌群比较

运动组大肠埃希菌、葡萄球菌水平低于空白组，乳酸杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌水平高于空白组，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。

表3 两组大鼠肠道菌群比较(±s)

表3 两组大鼠肠道菌群比较(±s)

组别空白组（n=12）运动组（n=12）t值P值大肠埃希菌7.87±0.95 7.02±0.87 2.286 0.032双歧杆菌7.71±0.86 8.90±0.94 3.236 0.004乳酸杆菌7.58±0.90 8.42±0.96 2.211 0.038大肠杆菌6.03±0.65 7.49±0.96 4.362<0.001葡萄球菌8.76±1.01 7.84±0.92 2.333 0.029

2.4 代谢组学指标与肠道菌群的相关性

Spearman相关性分析显示，尿液、粪便差异代谢物与大肠埃希菌、葡萄球菌呈负相关（P<0.05），与乳酸杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌呈正相关（P<0.05），见表4。

表4 代谢组学指标与肠道菌群的相关性

3 讨论

1982年第五届国际运动生化学术会议上将“运动性疲劳”正式定义为“身体机能的生理过程不能持续在特定水平和/或整体不能维持预定的运动强度”[3-4]。运动性疲劳属于应激反应的一种具体表现，对中枢神经系统会造成影响，易引发缺血缺氧性损害[5-6]。迄今，关于运动性疲劳的机制较多，其中能量消耗学说、保护性抑制学说、代谢产物堵塞学说、突变理论、疲劳链学说等较为常见[7-8]。但无论是哪一种学说，运动性疲劳的机制是非常复杂的。

既往研究表明，代谢产物的变化是对运动员进行有效运动训练监控的必要条件之一[9]。代谢组学应用于运动训练监控中，是通过检测机体特异的小分子代谢物质，评价运动员身体机能代谢调控状况[10-11]。肠道微生态系统在人体生理功能的发挥中扮演着非常重要的角色，在物质代谢、黏膜屏障形成、免疫系统发挥等方面作用显著[12]。既往研究发现，相较于其他群体，运动员的肠道菌群更明显且更广泛，加强对运动员和肠道菌群相关内容进行探究，可以更好地了解运动员的训练情况，为饮食的调整提供指导[13]。本研究结果显示，运动组尿液代谢物3-丁二醇、3-氨基异丁酸、柠檬酸、尿酸分别为（7.48±1.20）、（9.55±2.64）、（15.86±4.41）、（20.03±4.68），均高于空白组（P<0.05）；运动组粪便代谢物3-氨基异丁酸、戊糖醇、柠檬酸、D-葡萄糖酸、尿酸分别为（9.85±1.67）、（8.79±2.03）、（14.47±3.60）、（5.68±0.68）、（16.89±3.68），均高于空白组（P<0.05），说明相较于非运动大鼠，运动大鼠代谢速度更快，由此引起各指标的差异，这与临床相关报道类似。在马海峰等[13]研究中，针对中长跑运动员的尿液代谢组学特征进行探究，结果发现丁酸、异丁酸浓度等在训练后均有较为明显的升高。运动组大肠埃希菌、葡萄球菌水平分别为（7.02±0.87）、（7.84±0.92），均低于空白组，乳酸杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌水平分别为（8.90±0.94）、（8.42±0.96）、（7.49±0.96），均 高 于空白组（P<0.05）。谭迪等[14]对运动对小鼠肠道菌群的影响进行了分析，通过对比正常小鼠和运动小鼠的肠道菌群发现，运动小鼠的肠道菌群多样性更强，其中乳酸杆菌、大肠埃希菌等保护性菌群经测序后显示相似度分别为100%、98%。本研究中，Spearman相关性分析显示，尿液、粪便差异代谢物与大肠埃希菌、葡萄球菌呈负相关（P<0.05），与乳酸杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌呈正相关（P<0.05），说明了人体菌群和代谢与运动性疲劳之间有密切关系，由此可以看出，探讨运动性疲劳可能的发生机制，有助于为运动性疲劳的防治提供一个新的思路和治疗方法。

综上所述，运动性疲劳的发生与机体代谢组学及肠道菌群的变化密切相关，加强对机体代谢组学及肠道菌群的监测，对预防和减少运动性疲劳有着十分积极地意义。