含有苯环结构的PBAT微塑料生物降解对土壤微生物群落结构的影响

李成涛　吴婉晴　梁右才　崔倩　李振慧

摘要：为进一步探明以对苯二甲酸（PTA）作为合成单体的聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯（PBAT）在生物降解过程中，是否会产生类似于其它芳香类有机污染物的毒性效应，本研究以PBAT微塑料为研究对象，同时以PTA为参照，通过高通量测序考察不同粒径、不同添加量的PBAT微塑料的生物降解对土壤微生物群落结构的影响，分析评价PBAT微塑料的毒性-剂量效应.结果表明，PBAT微塑料的降解率与其添加量、粒径大小及填埋时间有关；PBAT微塑料的粒径、添加量以及填埋时间的不同会导致土壤样本中细菌群落相对丰度的动态变化，进而影响微生物群落结构，且与PTA存在差异，可能与其苯环结构有关.PBAT微塑料的添加降低了土壤中变形菌门和放线菌门丰度，但提高了酸杆菌门丰度.本研究结果对评价土壤中PBAT微塑料的生态风险、开发可有效降解微塑料的微生物资源具有重要意义.

关键词：微塑料； PBAT； 苯环； 生物降解； 土壤； 微生物群落

中图分类号：X172文献标志码： A

Effects of biodegradation of PBAT microplastics with benzene ring

structure on soil microbial community structure

LI Cheng-tao WU Wan-qing LIANG You-cai CUI Qian LI Zhen-hui

CHEN Chen LI LiKONG De-yi（1.School of Environmental Science and Engineering， Shaanxi University of Science & Technology， Xi′an 710021， China； 2.No.1 Oil Production Plant of PetroChina Changqing Oilfield Branch， Yan′an 717400， China）

Abstract：In order to further investigate whether poly （butylene terephthalate adipate） （PBAT） with terephthalic acid （PTA） as the synthetic monomer will produce toxic effects similar to other aromatic organic pollutants in the process of biodegradation，PBAT micro plastics were used as the research object and PTA as the reference.The effects of biodegradation of PBAT micro plastics with different particle sizes and different amounts on soil microbial community structure were investigated by high-throughput sequencing，and the toxicity-dose effect of PBAT micro plastics was analyzed and evaluated.The results showed that the degradation rate of PTA micro plastics was related to its addition amount，particle size and landfill time，and the difference of PBAT micro plastics particle size，particle size and landfill time would lead to the dynamic change of the relative abundance of bacterial community in soil samples，and then affect the microbial community structure，which was different from PBAT micro plastics，which may be related to its benzene ring structure.The addition of PBAT micro plastics decreased the abundance of Proteobacterium and Actinomycetes in soil，but increased the abundance of Acidobacteriota.The results of this study are of great significance for evaluating the ecological risk of PBAT micro plastics in soil and developing microbial resources that can effectively degrade micro plastics.

Key words：micro plastics； PBAT； benzene ring； biodegradation； soil； microbial communitysimulation

0引言

塑料因其成本低、延展性好和經久耐用等优点，被广泛应用于工农业生产和日常生活中［1］，已和钢铁、木材、水泥并列成为当今世界四大支柱材料，常见种类有聚乙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚酰胺、聚丙烯等.然而，大量的废弃塑料在环境中长期残留，难以回收且大多难降解，对环境造成了严重的“白色污染”［2］.面对当前日益严重的环境危机和国家推行的“限塑令”政策，可生物降解塑料使用规模逐年增加［3］，其中以对苯二甲酸（p-phthalic acid，PTA）为单体合成的聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯（butyleneadipate-co-terephthalate，PBAT）作为一种热稳定性、力学性能、生物降解性优良的材料，在对抗“白色污染”问题中具有重要的使用价值［4］.

随着可生物降解塑料的大量开发与使用，其对环境中塑料废弃物的贡献也相应增加［5］，虽然可生物降解塑料在微生物的作用下会发生降解，但其降解受多种因素的影响，如温度、湿度、pH值、降解时间、聚合物密度以及微生物种类等［6-8］，且随着其降解时间的延长，塑料分子量逐渐降低，继而会产生更小的塑料颗粒或碎片，当其粒径小于5 mm时即被定义为可生物降解微塑料.

近年来关于微塑料的研究大多集中在水体，但已有研究证明土壤可能含有更丰富的微塑料储层［9，10］，且土壤环境中的微塑料更有可能与微生物相互作用并改变生物地球化学循环，进而引发环境毒性［11］.土壤中的不可降解微塑料会对土壤生态系统造成多种影响，如影响土壤结构、微生物活性与活动、养分循环等［12］，有少数研究证明可生物降解微塑料对土壤生态系统功能的影响与不可降解微塑料相似［5，13］，但在其生物降解过程中，聚合物和降解中间体对土壤微生物群落的影响在很大程度上是未知的，仍需进一步探究.

刘娜等［14］研究苯酚对土壤中微生物数量及蛋白酶和脲酶活性的影响时发现，苯酚对土壤中细菌、放线菌及真菌等三大类群微生物均有显著影响；刘苹等［15］研究三种酚酸类化感物质（肉桂酸、邻苯二甲酸、对羟基苯甲酸）及其混合物对花生根际土壤微生物及产量的影响时发现，三种酚酸类物质的累积与花生根际微生物群落结构变化、微生态环境劣化相关，是花生连作障碍产生的可能因素之一.以PTA为单体的可生物降解脂肪-芳香族共聚酯PBAT同样含有苯环结构，在其使用过程中PBAT自身及其降解产物是否会产生类似的生态毒性问题，目前尚未明确.

本研究以PBAT微塑料为研究对象，同时以单体PTA为参照，通过高通量测序技术探究不同粒径与添加量的PBAT微塑料降解过程对土壤微生物菌群结构的影响，这对综合分析评价PBAT微塑料对土壤生态系统的潜在影响具有重要意义，为开发能够有效降解微塑料的微生物资源、维护土壤环境健康以及塑料加工行业的健康绿色发展提供了理论依据与技术支持.

1实验部分

1.1材料与样品

将洗净并干燥后的PBAT塑料母粒（广东金发科技有限公司）经粉碎机机械破碎后，通过筛分得到粒径分别为<0.1 mm，0.1～0.2 mm，0.2～0.5 mm的微塑料颗粒.实验前，将微塑料置于无菌工作台中灭菌20 min以最大程度减少微生物的污染［12］.实验所用土壤采自中国西安市郊的土地，去除土壤中石头及其他大块杂物后，使用10目（2 mm）筛网对土壤进行筛分，并将其置于25 ℃的环境箱中温育1周，以保持天然土壤微生物的活性［16］.

1.2PBAT与PTA污染土样的制备

实验所使用PBAT母粒中PTA含量约为50%，因此设置PTA添加量为PBAT的50%.称取250 g土壤放入每个花盆，分别按土壤干重的质量分数0.02%、0.2%的PBAT微塑料、0.01%、0.1%的PTA（天津市天力化学试剂有限公司）添加到土壤中，并进行编号（表1），添加量是根据土壤经可生物降解地膜覆盖的实际用量、累积量和已报道的高度污染的土壤中不可降解微塑料的最高浓度［17，18］确定的，将微塑料与土壤均匀混合，每组3个平行，同时对空白对照样本进行等效搅拌.将所有花盆放于室内，加入适量水后于室温下进行降解，降解期间定期适量加水并分别于20 d、40 d后进行取样测定.

1.3土壤中PBAT微塑料的提取

参照Li等［19］的方法，具体步骤如下：通过磁力搅拌装置将分离池中的浮选溶液（饱和NaBr）和样品搅拌均匀，静置后分离池中的样品分层，然后储液罐中的浮选液通过进液管流入分离池中的上层，同时利用曝气泵的曝气头处产生的气泡带动含有MPs的上层溶液流入到抽滤装置中进行过滤，从而达到分离目的.该分离提取装置对土壤中微塑料的回收率约为94%.

1.4PBAT微塑料降解性能分析

使用失重法测定PBAT微塑料的降解率，将填埋时间为20 d、40 d土壤中的PBAT微塑料进行分离、提取，表面冲洗干净并干燥至恒质量后称重，分别计算PBAT降解率.PBAT微塑料的降解率按照下列公式（1）进行计算：

降解率（%）=W₀-W_t/W₀×100%（1）

式（1）中：W₀为微塑料初始添加量，W_t为微塑料实际回收量/回收率（94%）.

1.5土壤微生物群落结构影响分析

使用高通量测序法对不同处理下的土壤样本进行分析，DNA抽提、16S rDNA特异引物 PCR扩增与测序在美吉生物医药科技有限公司（中国上海）完成，根据测序结果对微生物群落进行分析，在97%相似度的OTU或其他分类学水平下用QIIME计算，并利用R语言工具统计和作图.

1.5.1DNA抽提

根据E.Z.N.A. soil試剂盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）的说明书进行土壤样本中细菌群落总DNA的抽提，同时利用NanoDrop 2000检测DNA的浓度和纯度，制备1%琼脂糖凝胶进行电泳以检测DNA的提取质量.

1.5.2PCR扩增

细菌16S rRNA基因的PCR扩增是在DNA聚合酶的催化下，以母链DNA为模板，以338 F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R （5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）为特定引物对V3-V4可变区进行PCR扩增［20］，扩增方案为：在95 ℃下预变性3 min，95 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s的27个循环，以及最终在72 ℃下延伸10 min（PCR仪：ABI GeneAmp? 9700型），扩增体系为20 μL：5×FastPfu缓冲液4 μL，2.5 mM dNTPs 2 μL，每种引物（5 μM）0.8 μL，FastPfu聚合酶0.4 μL；DNA模板10 ng.

1.5.3Illumina Miseq测序

从2%的琼脂糖凝胶中回收所得的PCR产物，使用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）进一步纯化，然后进行Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测，并使用QuantiFluor^TM-ST（Promega，USA）进行检测定量.根据Illumina MiSeq平台（Illumina，San Diego，USA）标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE2*300文库，并利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序.

1.6数据分析

每组数据重复测定3次取平均值，利用Microsoft 2010 Excel软件计算均值和标准差，利用Origin 2018对不同组别的微塑料降解率进行绘图分析.原始测序序列由Trimmomatic软件进行质控，并使用FLASH软件进行拼接.使用UPARSE软件，根据97%的相似度对序列进行OTU聚类，并在聚类的过程中去除单序列和嵌合体，利用RDP classifier对每条序列进行物种分类注释，然后与Silva数据库（SSU123）进行比对，且比对阈值设置为70%.

2结果与讨论

2.1PBAT微塑料降解性能

图1为不同粒径、不同添加量的PBAT微塑料在不同降解周期下的降解率.由图可知，不同粒径、不同添加量的PBAT微塑料降解率均随着填埋时间的延长而升高；粒径与填埋时间相同时，0.2%添加量的降解率比0.02%添加量的降解率略高；添加量与填埋时间相同时，粒径<0.1 mm的PBAT微塑料降解率略高.这些结果表明，PBAT微塑料的添加量与粒径大小会影响其降解率，添加量越大、粒径越小，PBAT微塑料的降解率越高.考虑到PBAT降解方式主要为生物降解，产生该结果的原因可能是土壤中PBAT微塑料含量的增大，对土壤中可降解PBAT的微生物的活性激活作用更强，从而加快PBAT的降解过程，且粒径越小比表面积越大，越有利于微生物在微塑料表面的附着，进而加快降解.

2.2添加PBAT微塑料、PTA的土壤微生物群落变化2.2.1微生物OTU分类学分析

由各土壤样本微生物OTU分类学结果（表2）可以看出，填埋时间20 d与40 d的PBAT微塑料土壤样本各水平群落物种的数目相对于对照土样均有所增长，而添加PTA土壤样本的群落物种数目变化与之相反.填埋时间为20 d时，对于粒径< 0.1 mm和0.1～0.2 mm的PBAT微塑料土壤样本，0.2%添加量的各水平群落物种数目大多高于0.02%，而粒径为0.2～0.5 mm的PBAT微塑料土壤样本，0.2%添加量各水平群落物种的数目低于0.02%；填埋时间为40 d时，0.2%添加量的PBAT微塑料土壤样本各水平群落物种的数目高于0.02%.粒径、添加量相同时，相比于20 d，填埋时间为40 d时土壤微生物群落丰富度更大，这可能是因为随着降解时间延长，PBAT的降解率升高，表明形态结构发生变化，更有利于不同种类的微生物在其表面进行富集.

PTA在填埋时间20 d、40 d时均表现出相反的作用，PTA的添加降低了土壤微生物群落的丰富度，这可能是由于PTA分子中所含的苯环产生了毒性，且不能为土壤中微生物提供营养供给，从而降低土壤微生物群落丰富度，而以PTA为单体合成的聚合物PBAT，无毒性或毒性较小，且可被土壤微生物所利用，因此可以提高土壤微生物群落的丰富度.以上结果表明，PBAT微塑料的添加提高了土壤微生物群落的丰富度，且丰富度受其添加量、粒径及填埋时间的影响，呈现一定的剂量-毒性效应，例如短（20 d）填埋时间下的小粒径（<0.2 mm）PBAT，相比低添加量，高添加量会显著（p<0.05）增加土壤细菌群落的丰富度，但大粒径则与之相反；另外，填埋时间越长，对土壤微生物群落的丰富度影响越大.

2.2.2微生物群落Alpha多样性指数

以chao、ace、simpson、shannon、coverage指数为主，对20 d和40 d各土壤样本进行Alpha多样性分析（表3）.chao、ace指数越大，土壤细菌群落丰富度越高；simpson指数越大、shannon指数越小，土壤细菌群落多样性越低；coverage指数越大，土壤细菌群落覆盖度越高［21］.由表3可以看出，对于填埋时间为20 d和40 d的土壤样本，添加PBAT微塑料土壤样本的ace、chao指数大部分高于空白土样，且40 d相比于20 d更高，而添加PTA的土壤样本低于空白土样；添加PBAT微塑料土壤样本的shannon、simpson指数与空白土样相差不大，而添加PTA的土壤样本与空白土样间存在显著差异.上述结果表明，PBAT微塑料的添加可以提高土壤中微生物群落的丰富度与多样性，而PTA的添加降低了土壤微生物群落的丰富度与多样性，且随着降解时间的延长，PBAT降解产物可能被更多的微生物所利用，使得土壤群落丰富度与多样性进一步升高.

2.2.3微生物群落组成分析

将各组平行样本合并，按所有物种相对丰度进行计算并按物种丰度降序排列，丰度小于0.01的合并為others，在门水平、属水平构建群落组成图（图2、图3）.由图2可以看出，16种土壤样本的群落共鉴定出10个门，分别为变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteriota）、酸杆菌门（Acidobacteriota）、绿弯菌门（Chloroflexi）、拟杆菌门（Bacteroidota）、芽单胞菌门（Gemmatimonadota）、粘球菌门（Myxococcota）、厚壁菌门（Firmicutes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）和浮霉菌门（Planctomycetota）.其中，变形杆菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteriota）在16种土壤样本中丰度均相对较高，为主要的优势细菌门，这与其他土壤中微生物群落结构的研究结果一致：Zhang等［22］发现地膜覆盖的新疆棉田土壤样本及大型塑料、微塑料、植物凋落物样本中最主要的细菌门是放线菌门和变形菌门；Chen等［23］研究高碳或低碳条件下可生物降解的聚乳酸微塑料对土壤微生物和相关生态过程的影响时发现，土壤样本中大部分序列属于变形杆菌和放线菌门.

变形菌门和放线菌门在各土壤样本中占比分别在23.51%～43.14%和23.80%～31.52%之间，随着填埋时间的延长，空白土样与添加PBAT微塑料土壤样本中的变形菌门丰度逐渐减小，而添加PTA土壤样本中的变形菌门丰度逐渐增大，由29.97%增加至43.14%.填埋时间20 d时，与空白土样（31.52%）相比，添加PBAT微塑料与PTA的土壤样本中放线菌门占比均有所下降，且PTA土壤样本下降较明显（25.51%）；填埋时间为40 d时，比与空白土样（28.25%）相比，添加PBAT微塑料土壤样本中放线菌门占比大部分都有所下降，而PTA土壤样本有所升高，这说明PBAT微塑料的添加降低了土壤中变形菌门、放线菌门的丰度，而PTA的添加提高了变形菌门、放线菌门的丰度（40 d）.变形菌门、放线菌门存在多种可降解多环芳烃类［24］和高分子类化合物［25］的微生物，但由于PBAT降解中间产物的积累，可能对微生物有一定的抑制作用，导致变形菌门和放线菌门丰度的下降；随着时间的延长，变形菌门和放线菌门在添加PTA的土壤中丰度逐渐上升，可能是因为其能够利用PTA降解产物中的有机物成分作为生长基质生长繁殖.

各土壤样本中酸杆菌门占比在4.66%～22.74%之间，填埋时间20 d与40 d时添加PBAT微塑料土壤样本中酸杆菌门占比均高于同时间段的空白土样，且丰度随填埋时间的延长在升高，添加PTA土壤样本中酸杆菌门的丰度随填埋时间的延长在降低.这可能是因为PBAT在土壤中降解的过程可以产生对苯二甲酸［26］等中间物质，降低土壤的pH值，使得酸杆菌门［27］的丰度明显提高；而添加PTA的土壤起初降低土壤pH，酸杆菌门的丰度较高，但随着PTA的降解，土壤pH得以升高，使得酸杆菌门的丰度逐渐降低.正如张敏等［28］在研究PLA/PBAT对土壤细菌群落结构的影响时发现，使用PLA/PBAT地膜后，土壤中酸杆菌门、芽单胞菌门的相对丰度上升，变形菌门、放线菌门的相对丰度下降.

图3为各土壤样本在属水平上的群落组成柱形图.由图3可以看出，16种土壤样本中的群落共鉴定出44个属，随着填埋时间的延长，大部分添加PBAT微塑料的土壤样本中节杆菌属（Arthrobacter）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）的丰度均在减小；空白土样与PBAT微塑料土壤样本中诺卡氏菌属（Nocardioides）丰度随填埋时间延长在减小，而PTA土壤样本与之相反，说明添加PBAT的土壤环境不利于这些微生物的生长，其可能为添加PBAT的土壤样本的敏感菌.这可能是因为PBAT在降解过程中，塑料添加剂（例如邻苯二甲酸酯）会从微塑料基质中释放，而释放的这些化合物可能对这些细菌有害［29］；也可能是因为一些优势菌属和相对丰度升高的菌属的生长繁殖会抑制这些细菌的生长繁殖，使其丰度降低.

综上，PBAT微塑料的粒径、添加量以及填埋时间的不同会导致土壤样本中细菌群落相对丰度的动态变化，进而影响细菌群落结构，且与PTA存在差异，正如Qi等［30，31］研究地膜残留对小麦根际及土壤性质的影响时，在宏观和微观尺寸的可生物降解塑料碎片上均观察到微生物群落的变化，添加可生物降解塑料PLA会导致土壤pH值降低，从而间接改变根际土壤的微生物群落.有些细菌适宜在添加有PBAT的土壤环境下生长，为添加PBAT微塑料的土壤的耐受菌，这些耐受菌能够利用PBAT降解中间产物作为碳源进行生长繁殖［32］，同时也实现了PBAT的降解；而有些细菌不适合在含PBAT的土壤环境下生长［33］，可能为添加PBAT微塑料土壤的敏感菌门，也可能是因为一些优势菌属和相对丰度升高的菌属的生长繁殖会抑制这些细菌的生长繁殖，使其丰度降低.

2.2.4微生物群落Venn图分析

在属水平，利用Venn图统计多组样本中所共有和独有的OTU数目，根据填埋时间将添加PBAT微塑料的土壤样本分为20 d、40 d两组，图4为填埋20 d、40 d的PBAT微塑料土壤样本在属水平下的Venn图.由图可直观地看出，20 d和40 d的土壤样本的物种组成相似性及重叠情况，两组样本共有属的物种数目为802个，填埋时间20 d的土壤样本特有属的物种数目为36个，填埋时间40 d的土壤样本特有属的物种数目为51个，这表明PBAT微塑料的添加会增加土壤中微生物群落的多样性，且随着填埋时间的增长其属的物种数目在增加.

图5为所有土壤样本在属水平下共有和特有的细菌数.由图可以看出，16个土壤样本中微生物群落共有属的物种数目为404个，柱形部分代表各土壤样本中属水平下的总物种数目，各PBAT微塑料土壤样本的总物种数目高于空白土样，而PTA土壤样本低于空白土样.这表明PBAT微塑料的添加会增加土壤中微生物群落的多样性，且随着填埋时间的增长其属的物种数目是增加的，而PTA的添加会降低土壤中微生物群落的多样性.

图6为所有土壤样本在种水平下共有和特有的细菌数.由图可以看出，16个土壤样本中微生物群落共有属的物种数目有717个，填埋时间20 d与40 d添加PBAT微塑料土壤样本的特有物种数目与总物种数目均高于同时间段的空白土样，且40 d高于20 d，而添加PTA的土壤样本总物种数目均低于空白土样，各土壤样本的特有物种数目随填埋时间的延长在增加.这表明，PBAT微塑料的添加使得土壤样本的微生物多样性升高，随着降解时间的延长，这种促进作用更显著.

2.2.5微生物群落PCoA图分析

图7为门水平下添加PBAT微塑料的土壤系统的细菌主成分的PCoA图，横、纵坐标表示两个占比最大的主成分，百分比表示主成分对样本组成差异的贡献值，样本点越接近物种组成越相似.由图可知，填埋时间20 d（图7（a））的样本中细菌物种组成差异贡献值百分比分别为60.27%和30.16%，通过PC2（30.16%）将添加PBAT微塑料的土壤样本分离在图的下侧，与PTA土壤样本存在显著差异；填埋时间40 d（图7（b））的样本中细菌物种组成差异贡献值百分比分别为77%和14.9%，通过PC1（77%）將添加PBAT微塑料的土壤样本分离在图的右侧，且与PTA土壤样本存在相对较远的距离.

添加PBAT微塑料的土壤微生物群落組成与PTA存在显著差异，降解时间20 d和40 d间也存在一定差异，这可能是由于微塑料表面繁衍的细菌类群受微塑料本身的理化特性的影响［34］，因此对于不同种类的聚合物PBAT和PTA，以及不同降解时期，其表面及土壤中繁衍的细菌类群也不同，进而使得土壤生物群落组成也产生差异.Meng等［35］研究可生物降解育苗盘对稻田土壤微生物群落的影响时发现，黑钙土和潮土中较高施用量的样品与空白对照及较低施用量的样本显著分离.

3结论

PBAT微塑料在土壤中的降解率与其添加量、粒径大小有关，添加量越大、粒径越小，降解率越高.

PBAT微塑料、PTA对土壤微生物群落结构均产生影响，并且可能与其苯环结构有关.PBAT微塑料的添加可以提高土壤中微生物群落的丰富度与多样性，而PTA则与其相反，且与粒径、添加量及填埋时间有关，PBAT微塑料对土壤微生物群落丰富度的影响呈现一定的剂量-毒性效应.

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【責任编辑：蒋亚儒】