胰腺α细胞向β细胞转分化研究进展

高媛媛 陈 琦 袁 莉

糖尿病是一种以持续高血糖为特征的常见慢性病,如果不加以控制会导致严重并发症,影响患者生存质量甚至导致死亡。现有疗法只能帮助缓解高血糖症和并发症的进展,达到治愈的目的仍遥遥无期。因此,糖尿病的最终治疗需要研发β细胞替代策略来补偿胰岛素缺乏。通过胰岛移植弥补1型糖尿病患者丢失的β细胞,在稳定血糖方面表现出显著的益处。但胰岛供体的缺乏以及健康胰岛难以避免免疫攻击限制其广泛应用[1]。因此,β细胞的内源性再生成为了备受关注的话题。α细胞是β细胞替代的理想来源:①α细胞和β细胞来自共同的内分泌祖细胞,有密切的谱系关系;②α细胞增生在糖尿病动物和患者中很常见,构成了转分化的潜在丰富来源;③α细胞分泌胰高血糖素促进血糖升高,若α细胞转分化为β细胞将减少其数量,有助于降血糖;④在β细胞极度缺失后,α细胞转分化为β细胞是可行的[2]。为了使α细胞更多地转分化为β细胞,必须了解β细胞发育和再生的相关机制,以及有哪些手段可以促进该转分化的发生。

一、胰腺β细胞发育、分化过程

人类胰腺来自内胚层的背侧和腹侧,在胚胎的不同时期形成背侧和腹侧胰腺芽,这些胰芽由表达胰腺十二指肠同源框蛋白1(Pdx1)的多能祖细胞组成,随后,多能祖细胞分化为尖端和双能干细胞。尖端细胞进一步分化为腺泡细胞,而双能干细胞分化为导管细胞或内分泌细胞。在内胚层背侧和腹侧区域的Pdx1+细胞是内分泌祖细胞的起始[3]。神经元素3(Ngn3)是始动内分泌祖细胞分化为内分泌细胞的关键转录因子[4]。由于髓鞘转录因子1(Myt1)和Ngn3的表达不同,使内分泌祖细胞呈现异质性。Myt1+、Ngn3+的内分泌祖细胞向β细胞发育,Myt1-、Ngn3+细胞向α细胞发育[5]。肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A(MafA)促进β细胞最终成熟,NK6同源盒1(Nkx6.1)仅存在于β细胞中,如果缺少Nkx6.1会导致β细胞发育异常,而不影响胰腺中其他细胞的分化与发育。最后分化成熟的β细胞表达Pdx1、MafA、Nkx6.1、NK2同源盒2(Nkx2.2)和配对盒基因6(Pax6)等转录因子。

二、参与α细胞向β细胞转分化的转录因子

参与胰岛β细胞分化的转录因子主要包括Pdx1、MafA、Pax4、Arx、Nkx6.1、肝细胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4α, HNF4α)等相关的转录因子,这些基因协调表达决定了胰岛β细胞的分化[6]。因此,增强β细胞标志基因表达和(或)抑制α细胞标志基因表达的因子可用于设计从体内α细胞再生β细胞或体外发育β样细胞的方案。

1．Pdx1:Pdx1是一种含有同源框的转录因子,在早期胰腺上皮形成、β细胞发育过程和成熟胰岛β细胞中必不可少。缺乏该因子的人类或小鼠无法产生导管、外分泌或内分泌细胞类型而导致胰腺发育不全。成熟β细胞中,Pdx1的消耗和减少会导致葡萄糖耐受不良,这表明Pdx1在维持β细胞功能中的关键作用[7]。Pdx1在胚胎内分泌祖细胞中的高表达导致围生期α细胞通过以胰岛素/胰高血糖素共表达为特征的中间阶段转化为β样细胞,并且细胞表型也发生变化,导致胰高血糖素阳性细胞转变为胰岛素阳性细胞。敲除成熟β细胞中Pdx1,并用谱系示踪剂追踪,发现Pdx1缺失导致β细胞身份丧失,获得了β细胞到α细胞重编程的超微结构、α细胞生理特征以及与内源性α细胞高度相似的转录谱[8]。

2.MafA:MafA是基本亮氨酸拉链家族转录因子成员,在胰腺后期发育中能检测到,可作为胰腺组织的特殊标志物[9]。在小鼠胰腺发育过程中失去MafA并不会改变胰岛素阳性细胞的比例,然而缺乏MafA的小鼠在出生后会患上糖尿病,这表明MafA调节β细胞成熟并且是成人β细胞胰岛素葡萄糖反应性表达所必需。MafA和Pdx1的共表达可促进胰岛α细胞向β细胞转分化。在一项动物实验中通过胰管输注携带Pdx1和MafA表达盒的腺相关病毒可将β细胞毒素诱导的糖尿病小鼠和自身免疫性非肥胖糖尿病小鼠中α细胞重新编程为功能性β细胞,也使血糖水平正常化持续4个月。在体外Pdx1和MafA的表达也能将人类α细胞重编程为β细胞[10]。

3.Pax4:Pax4在胰腺早期分化及成熟胰岛细胞增殖过程中起重要作用。早期在胚胎胰芽中表达,晚期局限于分化的β细胞中,胰腺发育成熟后便不再表达。Pax4在胚胎α细胞中异位表达后,会导致其发育为β样细胞,这表明了Pax4对诱导分化胰腺内分泌细胞为β细胞的重要性。通过腺病毒将Pax4转入αTC1.9细胞中,可导致胰岛素合成增加和胰高血糖素抑制,并上调β细胞转录因子Pdx1、MafA、Ngn3和Nkx6.1的表达。此外携带Pax4表达盒的腺病毒直接输注到胰腺中会导致糖尿病小鼠的葡萄糖耐量略有改善[11]。因此,胰岛中Pax4高表达不仅增加了β细胞质量,也使葡萄糖耐量得到改善。

4.Nkx6.1:Nkx6.1是一种含有同源框的转录因子,在胰腺发育的早期以及成人β细胞中表达。它通过同时诱导β细胞基因和抑制非β内分泌基因来促进β细胞数量的增加。例如Nkx6.1可通过与Arx基因激活剂Isl1的竞争直接抑制Arx。当β细胞中Nkx6.1缺失时,β细胞转分化为δ细胞,不会转分化为α或胰多肽生成细胞。Nkx6.1在Ngn3阳性区域中表达并不能促进β细胞分化发育,而当Nkx6.1在Pdx1阳性区域表达时,β细胞的分化发育完全恢复,提示Pdx1和Nkx6.1在β细胞分化与发育过程中及维持β细胞正常功能等方面可能具有重要的协同作用[12]。

5.Arx:Arx是维持α细胞表型所需的转录因子,其在α细胞中选择性抑制后,可以促进α细胞转化为β样细胞。Chakravarthy等[13]灭活Arx和DNA甲基转移酶1(Dnmt 1),3个月内导致α细胞向β细胞的转变。新形成的β细胞在用RNA序列分析和谱系追踪其基因表达时类似于天然β细胞,新β细胞的葡萄糖刺激胰岛素分泌试验也呈阳性。生理学研究表明,转化的α细胞获得标志性的β细胞电生理学,并显示葡萄糖刺激的胰岛素分泌,表明Arx是α细胞介导的β细胞新生主要触发因子。

6．Hnf4α:Hnf4α是调节许多负责维持成人β细胞基因表达所必需的关键转录因子,据报道,它可以抑制胰高血糖素表达,诱导胰岛素表达和分泌,并上调其他β细胞表型标志物,如Pax4、葡萄糖转运蛋白2(glucose transporter-2, GLUT2)和葡萄糖激酶(glucokinase, GCK)。αTC1.9细胞系中Hnf4α的过表达上调Pax4,并抑制αTC1.9细胞中胰高血糖素的表达。Hnf4α具有诱导β样细胞表型-胰岛素表达和胰岛素分泌的潜力,这包括β细胞特异性GLUT2以及未加工的胰岛素原C肽成分的表达,还包括以葡萄糖剂量依赖性调节方式分泌胰岛素的能力[14]。尽管Hnf4α在αTC1.9细胞中诱导了显著的表型变化,但一些重要的β细胞转录因子如Pdx1没有被诱导,因此重编程并不完整。

三、促进α细胞向β细胞转分化的分子

1.γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA):GABA是一种广泛存在于中枢和外周神经系统的抑制性神经递质,由谷氨酸脱羧酶作用于谷氨酸合成。研究发现,用GABA处理啮齿动物可将α细胞转化为大量β样细胞[15]。Ben-Othman等[16]研究认为,用GABA处理αTC1.6细胞,可以抑制α细胞中Arx的表达,并使Arx从细胞核转移到细胞质,导致胰高血糖素表达减少,胰岛素和Pax4表达增加,说明GABA有利于体内α细胞向β细胞的转化。Li等[17]创造了一种诱导型Arx过表达的小鼠Min6细胞系,并寻找能抑制Arx功能的药物,发现青蒿素家族的抗疟药物(特别是蒿甲醚)能增强体内GABA信号,体外研究发现可改善人胰岛细胞葡萄糖刺激的胰岛素释放,改变人类胰岛的基因谱,诱导α细胞转化为β细胞。

青蒿素已在临床上用于疟疾治疗,尽管有庞大的患者队列,但关于青蒿素对人类胰腺内分泌功能影响的体内研究数据仍然缺乏。除了在小鼠细胞系中观察到青蒿素和GABA的作用,后续在小鼠(使用谱系追踪)、大鼠和斑马鱼体内也得到证实。但近年来有研究表明,使用青蒿素或GABA对小鼠进行长期治疗后,并没有刺激α细胞向β细胞转分化或胰岛素分泌,因此对此途径提出了质疑[19]。

2.胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide-1, GLP-1):GLP-1是肠道L细胞因食糜刺激而分泌,已知具有重要的生理作用,它能诱导胰岛素基因转录和胰岛素生物合成,增强葡萄糖刺激的胰岛素分泌,增强β细胞增殖,并抑制β细胞凋亡[20]。研究发现,胰腺α细胞是GLP-1作用靶点,在体外应用GLP-1激动剂(Exendin-4)和体内应用表达GLP-1的重组腺病毒(rAd-GLP-1)处理可促进α细胞增殖和转分化。由GLP-1引起的α细胞扩增和转分化可能有助于β细胞补偿。用rAd-GLP-1处理小鼠,发现小鼠胰腺β细胞比例增加,说明rAd-GLP-1处理的小鼠中α细胞可能转分化为β细胞,并且由GLP-1引起的α细胞增殖不会对葡萄糖的代谢控制产生不利影响。

成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21, FGF21)是一种在肝脏中高表达的循环蛋白,在胰腺的α细胞和β细胞中也能检测到其表达[21]。FGF21能诱导α细胞中Pdx1和Ngn3产生,刺激β细胞形成,而GLP-1通过α细胞中cAMP的增加,提高FGF21表达水平。用rAd-GLP-1或Exendin-4可以诱导FGF21,并随后增加β细胞转录因子[22]。因此,GLP-1能增强Pdx1和Ngn3的表达,促进体外人胰岛细胞和小鼠体内α细胞向β细胞的转分化。然而GLP-1作为一类广泛使用的降糖药物,其降糖效应是否涉及人胰岛α细胞向β细胞的转分化,还需进一步临床研究。

3.胰高血糖素受体单克隆抗体(GCGRmAb):GCGRmAb通过抑制胰高血糖素功能不仅可以改善血糖控制,还可以促进db/db小鼠和HFD+STZ诱导的T2D小鼠的胰岛素分泌并增加β细胞质量[23]。GCGRmAb处理促进了α细胞回归到祖细胞状态,并诱导了祖细胞衍生的β细胞新生[24]。Cui等[25]通过使用了可诱导的Ngn3+细胞谱系追踪2型糖尿病小鼠,发现GCGRmAb组胰岛素阳性细胞比对照组多,表明GCGRmAb在2型糖尿病小鼠中诱导胰腺内分泌祖细胞重新激活并向β细胞分化。此外,发现GCGRmAb增强了胰岛素分泌并上调了培养的原代小鼠胰岛中与β细胞再生相关的基因的表达(Ngn3、Glut2和Pdx1),表明GCGRmAb对胰岛细胞表型转化有直接影响。

4.达格列净:达格列净是SGLT2抑制剂,除降糖作用外对β细胞具有直接保护作用。达格列净上调啮齿动物胰岛和αTC1.9细胞中胰腺祖细胞和β细胞特异性标志物mRNA水平,表明达格列净可能诱导α细胞转化为β细胞,并通过使用α细胞谱系追踪证实α细胞转化为β细胞。此外,达格列净上调Pcsk1(编码激素原转化酶1/3,一种将胰高血糖素前体加工成GLP-1的重要酶)的表达,并增加αTC1.9细胞中GLP-1的含量和分泌[26]。鉴于GLP-1具有增强β细胞增殖,促进干细胞向β细胞分化,并诱导α细胞到β细胞转分化的能力,因此,达格列净对β细胞再生的促进作用可能部分通过α细胞分泌的GLP-1介导。还发现达格列净上调了培养的原代啮齿动物胰岛和αTC1.9细胞中Hnf4α的表达,如前所述Hnf4α促进α细胞向β细胞的转化[14]。因此,Hnf4α可能参与了达格列净诱导的胰腺内分泌细胞表型转换。

5.白藜芦醇:白藜芦醇已成为一种很有前途的降糖药,有研究报道其能诱导胰腺α细胞中几种β细胞基因表达和胰岛素生成。白藜芦醇增加关键β细胞转录因子的表达,例如Pdx1、Ngn3、NeuroD1、Nkx6.1以及FOXO1。用白藜芦醇处理细胞24h后,发现在细胞中以SirT1依赖性机制显著增加小鼠胰岛素mRNA的表达,而胰高血糖素mRNA没有显著改变。将HDAC抑制剂与白藜芦醇结合使用可进一步增强mRNA和蛋白质水平的胰岛素诱导[27]。

6.BRD7389:小分子BRD7389对α细胞具有特异性,可在终末分化的α细胞中以剂量依赖性上调胰岛素和Pdx1的表达。BRD7389还增加人原代胰岛细胞中β细胞特异性基因的表达,可能涉及的机制是BRD7389抑制p90核糖体S6蛋白激酶(Rsk)激酶活性,导致胰岛素表达增加[28]。Rsk是高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,可作为Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的下游效应器调节葡萄糖稳态。BRD7389在体外和细胞培养中具有作为Rsk家族激酶抑制剂的活性,通过同时抑制多个Rsk家族成员发挥作用,促进胰岛α细胞向β细胞的转分化。

综上所述,α细胞在β细胞数量急剧减少的条件下可转分化为β细胞的研究,提示α细胞可作为新的β细胞产生来源。成熟β细胞表达Pdx1、Ngn3、Pax4、MafA、Nkx6.1等转录因子,成功的转分化即通过各种方式使α细胞表达β细胞标志物和(或)抑制α细胞标志物的表达,并使新形成的β样细胞具有一定的生物学功能。几种临床药物包括GLP-1、达格列净和GABA,已被证明可促进成年啮齿动物β细胞增殖,但在人体中是否具有相同的作用还缺乏相关数据。此外,转分化细胞的生理调节功能仍需进一步研究,例如细胞是否在低葡萄糖条件下终止胰岛素分泌,或者细胞是否对各种生理刺激如增加的代谢需求有反应,因此后续还需不断地探索研究。总而言之,以α细胞转分化为β细胞作为增加功能性β细胞数量的靶点,在糖尿病治疗中具有巨大潜力。