糖尿病肾脏病生物学标志物的研究进展

杨其文 韩思宇 王莉华 李 元 周静威

我国糖尿病肾脏病(diabetic kidney disease, DKD)的发病人数随着糖尿病患病率的升高而迅速增加,在住院患者和普通人群中,糖尿病相关的慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)患病率均高于肾小球肾炎相关的CKD,成为我国CKD的首要病因[1]。同时在全球范围内,DKD是终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)的最常见病因[2]。基于DKD在国内外严峻的流行病学现状及其不良预后,可以认为DKD的防治是一项艰巨任务,而可靠的诊断和预测是减少DKD危害的基础策略。随着研究证据的增多,传统生物学标志物对DKD的预测能力暴露出了特异性和敏感度不足的问题,因此迫切需要寻找更好的新型生物学标志物来预测DKD的发生、发展。近年来的研究已发现多种颇具前景的预测DKD进展的新型生物学标志物,包括细胞因子和氧化应激标志物等,在此分别介绍传统和新型生物学标志物并评估它们预测DKD进展的可能性。

一、传统生物学标志物

1.肾小球滤过率:肾小球滤过率(glomerular filtration rate,GFR)是反映肾脏排泄功能的重要指标,同时也是临床预测ESRD的重要指标[3]。由于通过外源性物质直接测定血浆清除率的过程繁琐,且价格昂贵,目前临床多用基于血清肌酐的CKD-EPI公式或MDRD公式间接得出估算肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate,eGFR)[4]。

基线eGFR是常用的预测DKD进展的生物学标志物之一[5]。一项为期10年的观察性队列研究发现,基线eGFR是ESRD的重要预测因子[6]。另一项前瞻性研究发现,eGFR重度下降的2型糖尿病患者在10.2年内发生ESRD的风险比eGFR正常的患者增加了81.9倍[7]。eGFR的变化率同样具有重要的参考价值:ADVANCE-ON研究纳入了8879例2型糖尿病患者,经7.6年的随访后发现,eGFR的下降速率与发生ESRD的风险呈显著正相关[8]。基线eGFR水平和eGFR的变化率可以预测DKD的进展,但是对于eGFR水平正常且没有明显下降的DKD(尤其是DKD早期),eGFR难以独立预测其进展。

2.白蛋白尿:白蛋白尿是诊断DKD的重要依据之一,《中国糖尿病肾脏病防治指南(2021年版)》定义尿白蛋白/肌酐(urinary albumin-to-creatinine ratio,UACR)≥30mg/g或24h尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretion rate,UAER)≥30mg/24h为尿白蛋白增高[9]。UAER与UACR对DKD的诊断价值相当,但是因为UAER操作繁琐,临床上常用UACR判断DKD尿白蛋白水平[9]。

UACR是DKD肾功能进展的独立危险因素,当前被广泛地应用于预测DKD患者的ESRD风险[5,10]。UACR同时也是DKD患者的心血管事件和全因死亡率的独立危险因素[11,12]。

但随着研究证据的增加,UACR预测DKD进展的能力逐渐受到质疑。正常UACR的糖尿病患者可以出现肾功能进行性下降,UACR中度升高(UACR为30～300mg/g)的糖尿病患者也可以表现出稳定的肾功能。此外,糖尿病患者从UACR中度升高消退至正常水平是常见的现象[13]。34例UACR中度升高的2型糖尿病患者接受了肾活检,结果显示,1/3患者有典型的糖尿病肾小球硬化,1/3患者有更符合高血压肾硬化的非典型表现,其余1/3患者的肾脏组织学则表现为正常,说明UACR升高并不能很好地反映肾损伤情况[14]。UACR是目前临床广泛接受、相对可靠的预测指标,但是无论是其基线水平还是变化的趋势,均难以充分预测DKD进展,尤其是在UACR水平正常的患者中。肾脏组织学检查也证实了UACR和肾损伤之间欠佳的相关性。

二、新型生物学标志物

DKD涉及多个发病机制,包括血流动力学异常、炎性反应、氧化应激、纤维化等。近年来,越来越多的研究围绕上述机制展开,致力于寻找能更好地预测DKD进展风险的新型生物学标志物。基于近年的研究结果和进展,笔者列举了多种颇具代表性和潜在临床应用价值的新型生物学标志物,包括细胞因子和氧化应激标志物等。

1.炎性细胞因子及其受体:DKD曾被认为是为非炎性肾小球疾病,大量研究表明,低度炎症参与了DKD的发病。DKD的炎性反应是由多种机制诱导的,包括高血糖介导的细胞死亡、巨噬细胞的激活以及其他免疫细胞的参与等,进而引起基膜增生以及肾小管纤维化增加,最终加速肾小球硬化。

肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是炎症的关键介质,并在细胞凋亡中起着重要作用。来自Joslin糖尿病中心的两项研究表明,TNF-α及其受体的血清水平可能是预测1型和2型糖尿病肾脏病进展的理想生物学标志物[15]。在这两项研究中,sTNFR水平是eGFR下降的有力预测因素,sTNFR2水平处于前1/4的1型糖尿病患者达到CKD3期的累积发生率为60%,相比之下,sTNFR2水平处于后3/4的患者的累积发生率低于20%;在存在蛋白尿且sTNFR1水平在前1/4的2型糖尿病患者中,12年内进展为ESRD的风险接近80%,而sTNFR1水平处于后3/4的患者的风险小于20%,并且sTNFR1较UAER对GFR的预测能力更强。波士顿肾活检队列(BKBC)研究经65个月随访后发现,受试者基线sTNFR1、sTNFR2水平与eGFR水平呈较强的相关性,且随着sTNFR1、sTNFR2水平升高,肾功能进展的风险随之增加。慢性肾功能不全队列(CRIC)研究对894例糖尿病伴CKD的患者进行了随访,分析了多种与肾小管损伤、炎症和纤维化相关的生物学标志物,在调整了其他的危险因素后,发现较高水平的sTNFR1和sTNFR2与更快的DKD进展有关,且sTNFR2的风险比最高[16]。上述研究均证明,TNF-α和sTNFR是预测DKD肾功能进展的较为理想的生物学标志物,值得重视。

2. 转化生长因子β:转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)是一种参与血管生成、免疫调节和细胞外基质形成等生理过程的多效细胞因子。TGF-β家族被分为TGF-β1～TGF-β5 5个亚型,哺乳动物体内主要存在TGF-β1～TGF-β3 3个亚型,其中以TGF-β1占大多数。TGF-β1被认为是介导肾小球硬化和肾间质纤维化关键的细胞因子,其作用包括趋化和活化炎性细胞、介导肾小管上皮细胞向间充质细胞转变分化、刺激细胞外基质蛋白的合成、降低基质金属蛋白酶的活性和(或)增加蛋白酶抑制剂的合成以促进细胞外基质的沉积等。过度活跃的TGF-β1信号通路被认为是DKD慢性肾病进展中的关键促纤维化因子。陆静尔等[17]测定了127例糖尿病患者的血清TGF-β1水平。结果显示,糖尿病患者血清TGF-β1表达水平高于健康对照组,且糖尿病伴肾功能下降的患者血清TGF-β1表达高于肾功能正常的糖尿病患者,并计算出血清TGF-β1单独诊断糖尿病伴肾功能下降的敏感度、特异性及准确率分别为75.00%、72.26%和73.10%。该研究中TGF-β1的敏感度、特异性及准确率均高于临床常用的胱抑素C和尿素氮,说明其可能具有较好的预测DKD进展的能力。一项Meta分析纳入了48篇关于中国人群TGF-β1和DKD风险的临床研究,结果显示,高水平的血清TGF-β1与DKD的易感性以及DKD的进展相关[18]。目前关于TGF-β1预测DKD进展的前瞻性临床研究相对较少,其预测能力有待于进一步研究。

3.氧化应激标志物:氧化应激是DKD发病和进展的关键因素之一。过量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)被认为是高糖环境下产生的有毒中间体,它可以通过多种途径加重DKD进展。在生理状态下,肾脏会产生少量ROS,当肾脏固有细胞因高糖环境不能有效降低葡萄糖转运率以维持细胞内葡萄糖稳态时,这些细胞的线粒体产生过量ROS诱导氧化应激,进而导致DKD的发生和进展。

8-羟基脱氧鸟苷(8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine,8-OHdG)是ROS诱导核和线粒体DNA中鸟嘌呤碱8-羟基化后由特异性酶切的产物,被视为DNA氧化应激的生物学标志物。Sanchez等[19]测量并随访了两个队列共计704例1型糖尿病患者的基线血清8-OHdG水平,并分析了8-OHdG与随访期间eGFR、DKD和死亡风险等的关联,结果发现,较高的8-OHdG血浆水平与1型糖尿病患者DKD风险增加独立相关。王丹阳等[20]的横断面研究发现,尿液8-OHdG水平与2型糖尿病所致的DKD有较高的相关性,并认为尿液8-OHdG是反映DKD进展的生物学标志物。

4.晚期糖基化终产物(advanced glycation end product,AGE):AGE是体内蛋白质、脂质或核酸类大分子暴露于还原糖中生成的一组复杂的异质性物质,大量研究表明,AGE与代谢性疾病高度相关。AGE可通过改变蛋白质的生理功能、触发细胞级联反应,导致滤过屏障解体、引发氧化应激和肾脏纤维化进而加重CKD的进展。吴怡琪等[21]通过荧光检测糖尿病患者的皮肤AGE含量,发现DKD患者的皮肤AGE含量高于单纯糖尿病患者,且皮肤AGE含量随DKD进展而升高。

5.足细胞标志物:足细胞在维持肾功能方面发挥着重要作用,也是许多肾脏疾病的研究焦点。足细胞损伤导致足细胞衍生的细胞碎片和特定的分子目标脱落到尿液中,这可以作为潜在的生物学标志物。尿足细胞标志物已应用于多种肾脏疾病的诊断和监测。

nephrin蛋白是对维持足细胞裂孔隔膜功能有重要作用的蛋白。既往研究表明,在1型糖尿病患者中,有30%的患者在出现微量白蛋白尿之前,可在尿液中检测到nephrin蛋白。Kostovska等[22]研究发现,大部分UACR正常或升高的2型糖尿病患者中均能检测到相比健康对照组显著升高的尿nephrin蛋白,且尿nephrin蛋白水平与eGFR水平呈负相关。这表明尿nephrin蛋白可能先于尿微量白蛋白出现,是潜在的反映肾功能进展的早期DKD生物学标志物。

podocalyxin蛋白分布于足细胞表面,主要参与肾小球电荷屏障的形成。一项横断面研究发现,53.8%的2型糖尿病患者在出现微量白蛋白尿之前,尿podocalyxin蛋白水平就已经升高,因此对于DKD的早期检测,podocalyxin蛋白可能比UACR更加敏感。而在确诊的DKD患者中,podocalyxin蛋白水平与糖化血红蛋白和UACR均呈正相关[23]。Zeng等[24]研究认为,尿podocalyxin蛋白是足细胞标志物中最具潜力的DKD早期标志物。

6.急性肾损伤标志物:已有多种生物学标志物被发现可用于急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)的诊断及预测,而近年来的研究提示其中部分标志物对DKD也具有潜在的预测价值,包括中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)和肾损伤因子-1(kidney injury molecule-1,KIM-1),两者均是肾小管损伤标志物。

在DKD患者中,血清和尿液NGAL水平均高于健康人群,且与尿白蛋白水平呈正相关。一项前瞻性研究发现,尿液NGAL水平的升高与ESRD风险增加有关[25]。另一项前瞻性研究发现,尿液KIM-1水平的升高可能是eGFR早期下降的危险因素[26]。上述研究均提示,肾小管损伤很可能紧随DKD而发生,监测NGAL和KIM-1水平的变化对评估DKD的进展有重要的临床价值。

7.基于组学技术的标志物:组学是近年来发展迅速的技术,它通常将各类生物分子的集合所进行的系统性研究,主要包括蛋白质组学、代谢组学和基因组学等。组学可以在无假设的前提下进行分析,有助于减少研究的选择性偏倚。近年来,组学在DKD生物学标志物研究中的应用日益增多。

(1)蛋白质组学:Good等[27]对CKD患者和健康人群进行队列研究,使用毛细管电泳-质谱分析首次鉴定出273种潜在的生物学标志物组,称为CKD273。Zürbig等[28]检测了1014例无微量白蛋白尿的1型和2型糖尿病患者的尿液样本,发现CKD273的阳性预测值在总队列中是34%,在2型糖尿病患者中可达到47%。研究结果表明,CKD273能够一定程度地预测尿白蛋白排泄正常的糖尿病患者进展为DKD的可能。另一项前瞻性研究发现,在COX回归模型中校正其他危险因素后,CKD273可以独立预测DKD患者的远期死亡风险。CKD273在DKD的早期诊断和预测远期预后方面均具有较强的前景,但目前存在费用昂贵和依赖特殊检测设备的问题,加之其敏感度和特异性有待于进一步验证,因此尚未在临床中推广应用。

(2)代谢组学:Niewczas等[29]分析了进展为ESRD的2型糖尿病患者的血浆代谢组学特征,发现部分血浆代谢物包括对甲酚硫酸盐、假尿苷和肌醇等被认为与ESKD终点密切相关;该团队还分析了伴CKD的1型糖尿病患者的血清代谢组学特征,包括C-糖基色氨酸、假尿苷、O-磺基酪氨酸、N-乙酰苏氨酸、N-乙酰丝氨酸、N6-氨基甲酰苏酰腺苷和N6-乙酰赖氨酸共7种代谢物的血清水平与肾功能下降及ESKD终点密切相关。Tang等[30]对102例伴微量白蛋白尿的2型糖尿病患者进行了5～6年的随访,发现5-羟基己酸可用于识别有早期进行性肾功能下降风险的2型糖尿病患者。

(3)基因组学:DKD有较强的遗传易感性,但仍然很难确定其遗传病因。多项大型全基因组关联分析研究(genome-wide association studies,GWAS)确定了1型和2型糖尿病中对应各种DKD表型的基因和基因区域,关键基因包括RND3/RBM43、SLITRK3、ENPP7、GNG7、APOL1、GRAMD3、MGAT4C和GABRR1等,但是这些基因预测DKD进展的价值尚不明确[31～33]。总之,目前基因组学的研究结果很难用于DKD的临床预测。

三、展 望

DKD是ESRD的最常见病因,有研究者认为越来越多的ESRD由DKD进展而来,造成这一现象的主要原因之一是目前难以准确地识别高风险的糖尿病患者[34]。eGFR和UACR虽然并不完美,但仍然是目前最常用的、诊疗指南推荐的预测DKD进展的生物学标志物[4,9]。上述在研的部分新型生物学标志物因其显著的结果被研究者寄予厚望,遗憾的是它们目前均没有被用于临床一线。

有关DKD新型生物学标志物的研究也存在一些不足:(1)受限于研究方法:部分研究属于横断面研究,作为观察性研究的一种,无论其结果好坏,它只能提示暴露因素和结局的相关性而非因果关系。例如Kostovska等[22]的横断面研究认为,尿nephrin蛋白是比UACR更敏感的早期DKD生物学标志物,但是并不清楚尿中出现nephrin蛋白是否是因果机制的一部分,亦不能说明早期出现的尿nephrin蛋白总是能预测2型糖尿病在未来会进展为DKD。因此需要更多的前瞻性研究以解决上述问题。(2)缺乏横向比较:多数临床研究仅关注于某一个或某几个相同类型的新型生物学标志物,忽略了将新型和传统生物学标志物的预测能力进行横向比较;同时很少有前瞻性研究将多个不同类型的新型生物学标志物的预测能力进行横向比较。在如此多的新型生物学标志物中,尚不明确最具有预测潜力的、最可能成为未来研究重点的生物学标志物。

要有效防治DKD进展为ESRD,关键是寻找可靠的预测DKD进展风险的生物学标志物。DKD是一种复杂的异质性疾病,发病机制复杂,提示了其进展是多因素的[18]。虽然上述研究提示部分单一的生物学标志物具有较大的潜力,但是很可能只反映了DKD病理过程的一部分生物途径,换言之,单一的生物学标志物可能难以充分评估DKD的进展。多个生物学标志物联合评价DKD很可能是未来的研究方向。