miR-155在狼疮性肾炎细胞焦亡中作用机制的研究进展

吴昱升 林 栩

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种涉及对内源性核颗粒的不适当免疫反应而造成的自身免疫性疾病,能够影响多个器官和系统[1]。狼疮性肾炎(lupus nephritis,LN)作为一种免疫复合性肾小球肾炎,是SLE最常见和最严重的靶器官疾病之一[1]。LN的治疗主要以激素冲击和免疫抑制剂为主,但效果并不理想。10%～30%的LN患者在确诊后15年内发展为终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)[1]。因此,进一步研究LN的发病机制,有助于LN患者病情的早期诊断和治疗。LN的病理机制复杂,细胞焦亡作为一种伴随炎性坏死反应的程序性细胞死亡方式贯穿LN发生、发展的始终[2]。此外,自身反应性白细胞、免疫复合物和补体蛋白等也可以通过调节各种细胞的炎性介质在LN的发病机制中发挥重要作用。

microRNA (miRNA)是一种高度保守的非编码RNA分子,由约22个核苷酸组成,它们可以通过直接与mRNA的3′非翻译区(3′UTR)结合来调节靶基因的表达。miRNA主要参与多种信号通路并通过改变促炎介质的产生、免疫细胞反应、淋巴细胞功能、Toll样受体(Toll-like receptors, TLR)和核因子κB蛋白(NF-κB)信号通路在LN的发病机制中发挥作用[3]。miR-155作为miRNA家族的成员,可介导先天性和适应性免疫反应,在调节血细胞生成、炎症和免疫反应方面发挥重要作用[4]。目前有研究表明,脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)可诱导miR-155的表达,miR-155的表达失调可能是诱发LN等多因素疾病的潜在诱因[5]。本文就近年来miR-155在细胞焦亡及LN中的作用机制进行综述,旨在能为后续LN治疗及预后的研究提供帮助。

一、细胞焦亡的经典通路

细胞焦亡是一种针对细胞内危险信号做出反应的程序性细胞死亡反应模式,焦亡过程的主要特征是由炎性小体触发的gasdermin(GSDMD)蛋白家族介导的膜穿孔、细胞破裂和炎性细胞因子[包括白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)]的释放,促进炎性反应从而快速启动免疫应答过程。在细胞焦亡过程中,细胞膜受损并发生穿孔,由于胞内外渗透压的变化,细胞变得肿胀和破裂,膜完整性丧失引起炎性细胞因子释放[6]。然而,在这个过程中,线粒体的结构和功能保持完整[6]。由于依赖的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)不同,细胞焦亡可分为依赖caspase-1的经典途径和依赖人源caspase-4/5及鼠源的caspase-11的非经典途径。

经典细胞焦亡途径由病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)或损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern, DAMP)与位于细胞内的模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)相互作用,引起细胞内炎性小体激活并寡聚成多蛋白复合物介导级联反应,经典细胞焦亡主要通过两条信号通路实现其功能:第1条信号通路是PAMP或DAMP与细胞膜上的TLR结合,经过NF-κB通路引起细胞内白细胞介素-1β(pro-IL-1β)和白细胞介素-18(pro-IL-18)等前炎性细胞因子表达增加[7]。第2条信号通路是在PAMP或DAMP的刺激下,胞内PRR被激活,引起炎性小体多蛋白复合物组装,激活caspase-1,进一步切割pro-IL-1β、pro-IL-18、GSDMD,引起细胞焦亡。在非经典焦亡途径中,LPS可以直接与caspase募集结构域(CARD域)结合激活caspase-4/5/11并切割GSDMD,也可以通过炎性小体(NLRP3)-凋亡相关斑点样蛋白(ACS)-caspase-1途径从而促进细胞焦亡的发生[8]。

二、细胞焦亡的主要蛋白

caspase-1最初以IL-1β转换酶的命名被关注,caspase-1可以直接切割pro-IL-1β、pro-IL-18,使成熟的细胞因子在其细胞外释放时结合其同源受体,而caspase-11则需要激活NLRP3炎性小体以在非经典炎性体信号转导的背景下分泌细胞因子[9,10]。gasdermin家族是一类在细胞焦亡通路下游发挥胞膜成孔功能的蛋白质家族,gasdermin D(GSDMD)作为caspase-1/4/5/11的切割靶标,是细胞焦亡的关键执行蛋白,其他gasdermin超家族蛋白,如gasdermin E (GSDME),可以被caspase-3激活,caspase-3在癌细胞和正常细胞中均参与了细胞焦亡,caspase-8主要参与由耶尔森菌效应蛋(YopJ)通过抑制转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)激活激酶1从而引起的受体相互作用蛋白激酶1和GSDMD切割,进而导致细胞焦亡[11]。作为细胞焦亡的“执行者”,GSDMD活化后其N、C端自身相互作用被抑制,氨基末端片段(GSDMDN)具有成孔结构域,可以与细胞质膜的磷酸肌醇结合,导致细胞膜孔洞形成,细胞不断膨胀直至破裂,细胞内容物IL-1β和IL-18等释放,从而激活并放大炎性反应,引发细胞焦亡[12]。

IL-1β是白细胞介素家族的关键促炎性细胞因子,作为功能失活的蛋白质被储存在细胞质中,同时它也是细胞焦亡的主要分泌蛋白。pro-IL-1β的蛋白质表达主要局限于骨髓细胞,并进一步受到NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase MAPK)信号转导对其转录的调节,与IL-1受体1(IL-1R1)结合后会触发三级受体复合物并与IL-1受体辅助蛋白(IL-1RAcP)在效应细胞上组装,从而促进炎性介质的分泌、免疫细胞局部浸润、B细胞产生抗体以及T辅助17(Th17)反应的发展[12]。IL-18是γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)产生的刺激因子,也是自然杀伤细胞和T细胞功能的刺激剂,IL-18启动细胞焦亡过程的必要因子,主要通过p38蛋白的MAPK信号通路影响焦亡途径[13]。Jorgensen等[14]利用细菌感染的方法构建了体内细胞焦亡模型,发现IL-18等前炎性细胞因子启动了细胞焦亡;Kim等[15]研究发现,NLRP3炎性小体能够介导IL-18、IL-1β和caspase-1的分泌、活化从而引发细胞焦亡;Li等[16]研究发现,miR-30能够上调caspase-1、IL-1β和IL-18,启动心肌细胞焦亡。该研究提出一条高糖条件下启动心肌细胞焦亡的信号通路:miR-30d↑→fOXO3a↓→ARC↓→caspase-1↑→IL-1β、IL-18↑→细胞焦亡↑。

细胞焦亡主要是通过核苷酸结合寡聚化结构域NOD样受体(NLR)或Toll样受体(TLR)识别细胞内外PAMP和DAMP,进而促进炎性小体的激活而引发。NLR家族包括NLRP3、NLRP1、NLRC4等,NLRP3是当前研究最多的可形成炎性小体的内源性PRR,其可以被病毒、细菌、真菌、抗原抗体免疫复合物、成孔毒素、细胞外ATP、活性氧等通过JNK、MAPK、NF-κB信号通路激活[17]。研究发现,在SLE肾炎患者中,NLRP3的功能增益变异体出现频率更高,反映了NLRP3炎性小体不仅在SLE中且在肾脏疾病中起着重要的作用[18]。Fu等[19]研究发现,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶-1(Pim-1)是LN患者致病机制中的重要调节因子,并可以通过Pim-1/NFATc1/NLRP3通路调控LN的致病过程。

三、细胞焦亡参与LN的发生和发展

近年来,细胞焦亡在LN中发挥的作用被广泛关注,NLRP3/ASC/caspase-1、P2X7/NLRP3/caspase-1等信号通路在LN中的作用丰富了人们对LN发病机制的研究,为LN的靶向研究提供了基础[20]。有研究显示,在LN患者活检报告中,炎性小体成分(NLRP3/caspase-1)的表达明显增加,通过Kahlenberg等[20]构建的LN小鼠模型实验明确了炎性小体参与了LN的发生,而缺乏炎性小体中枢caspase-1的小鼠,则不表现出SLE和LN的症状,由此可以揭示细胞焦亡是LN的重要环节。

1.免疫细胞(巨噬细胞)焦亡参与LN的发生和发展:炎性小体作为细胞内的多蛋白复合物,积极参与炎症/自身免疫性风湿性疾病的发病机制,如类风湿关节炎、SLE等,其导致细胞焦亡和促炎性细胞因子的分泌在巨噬细胞的炎性反应过程中起到协调抗病原宿主防御的作用[21]。血液中的单核细胞可以在细胞因子的诱导下迁移到肾脏中转变为巨噬细胞,肾巨噬细胞和树突状细胞都是LN的关键参与者。Zhang等[21]研究发现,SLE患者体内抗dsDNA抗体可以与巨噬细胞中的TLR4结合,通过诱导ROS合成和K+外排激活SLE患者单核细胞或巨噬细胞NLRP3炎性小体并产生IL-1β,进而参与SLE的发病,并且巨噬细胞增高程度与血清抗dsDNA抗体水平以及疾病活动相关。

中性粒细胞胞外杀伤网格(neutrophil extracellular trap, NET)是中性粒细胞坏死或凋亡后形成的一种特殊结构,由促炎性狼疮中性粒细胞自发释放,被称为低密度粒细胞,它有助于免疫复合物的形成和Ⅰ型干扰素合成[22]。有研究显示,在SLE患者来源的巨噬细胞中,NET增多可以激活巨噬细胞中的NLRP3炎性小体,促进caspase-1的活化,进而导致IL-1β和IL-18的成熟和释放,诱导细胞焦亡的发生。重要的是,IL-18能够再次诱发NETosis,并导致前馈循环,加重SLE的复发和器官损害[23]。另有研究在pristine构建的LN小鼠肾损伤模型中,腹腔巨噬细胞中的NLRP3、caspase-1较对照组明显增加,并且其肾脏中F4/80巨噬细胞增多,肾损害明显。综上可以揭示肾脏中巨噬细胞焦亡在LN的发病机制中发挥重要作用。

2.肾脏固有细胞焦亡参与LN的发生和发展

(1)足细胞焦亡参与LN的发生和发展:足细胞是高度分化的上皮细胞,通过足突延伸固定在基膜上,与相邻足细胞相互作用,形成狭缝隔膜,即最终过滤屏障。这种狭缝隔膜是一种独特的细胞连接,由足细胞特异性蛋白质形成,如nephrin、P-cadherin和podocin,足细胞的结构和功能破坏往往对肾小球疾病的治疗和预后有着严重的影响[24]。Fu等[19]研究显示,在LN患者和LN小鼠足细胞中均出现NLRP3的激活,且caspase-1也随之升高,用NLRP3抑制剂MCC950治疗LN小鼠后,肾损伤和足细胞融合程度均得到有效缓解,表明NLRP3炎性小体参与LN足细胞损伤的发展。Guo等[24]研究显示,LN小鼠肾脏中NLRP3、caspase-1、IL-1β升高,人和小鼠足细胞中caspase-1升高,并表明在LN损伤过程中足细胞的受体相互作用蛋白3(RIP3)依赖的NLRP3炎性小体途径被激活。另有研究表明,anti-dsDNA抗体可以引起小鼠足细胞NLRP3和caspase-1激活。以上研究表明,足细胞焦亡参与了LN的肾损伤。

(2)肾小管上皮细胞焦亡参与LN的发生和发展:肾小管是肾脏的组成部分之一,肾小管损伤往往在早期肾脏疾病中就有所体现。研究显示,与正常肾组织比较,LN患者肾小管细胞中的caspase-1明显升高,在LN患者中,NLRP1主要在LN Ⅱ类和Ⅳ类肾小管细胞中表达,而NLRP3在LN Ⅳ类肾小管细胞中表达,且NLRP3的表达水平与LN患者的活动指数评分呈正相关,提示在LN中肾小管上皮细胞可能出现细胞焦亡。Chen等[25]研究发现,在IgA肾病中肾小管上皮细胞中NLRP3明显升高,并与其预后明显相关。提示在LN中肾小管上皮细胞可能出现细胞焦亡。这明确了肾小管上皮细胞焦亡参与LN的肾损伤机制。

(3)肾小球血管内皮细胞焦亡参与LN的发生和发展:研究表明,在高糖的刺激下,人肾小球内皮细胞中的IL-1β、IL-18、GSDMD明显升高,表明高糖诱导糖尿病肾病中的内皮细胞焦亡。在LN中常常伴随肾内血管损伤,所以在LN中内皮细胞也可出现焦亡[26]。Kahlenberg等[26]研究表明,来源于在SLE患者的血管内皮祖细胞或循环血管生成细胞中的炎性小体、caspase-1的含量是正常人的3倍。血管内皮祖细胞或循环血管生成细胞参与血管修复,是内皮细胞的前体。这表明了在LN中内皮细胞也可以出现细胞焦亡参与LN的肾损伤。

四、miR-155参与细胞焦亡的发生和发展

1.miR-155对巨噬细胞焦亡的影响:miRNA是一种长度为18～25nt的高度表达、高度保守的非编码小RNA,并且与癌症和炎症等多种疾病有关。miR-155在病原体诱导的宿主细胞增殖、分化和凋亡障碍中起重要作用,并且是巨噬细胞中重要的炎性介质。有研究表明,miR-155是巨噬细胞极化过程中的重要调节分子之一,miR-155在用牙龈卟啉单胞菌刺激的巨噬细胞中表达增加,当miR-155的表达被敲低时,巨噬细胞中的细胞焦亡率和NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18水平显著减少,巨噬细胞清除病原体的能力增强,提示miR-155在巨噬细胞焦亡中具有负性调控作用。多项研究发现,细胞因子信号转导抑制因子(suppressors of cytokine signaling, SOCS)1可以通过调节JAK/STAT通路抑制巨噬细胞炎性反应,而miR-155则通过下调SOCS1的表达并促进从pro-caspase-11到caspase-11的转化,这增加了NLRP3的表达并最终促进巨噬细胞发生焦亡。在miR-155沉默的巨噬细胞中,SOCS1表达增加,而caspase-11、caspase-1、NLRP3、GSDMD-NT、IL-1β和IL-18等一系列细胞焦亡经典途径关键因子表达降低。由此得出结论,miR-155的高表达模式通过调节SOCS1、JAK/STAT通路的表达来促进细胞焦亡。

2.miR-155对肾小管细胞焦亡的影响:肾缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)诱导的肾小管细胞死亡是急性肾衰竭(acute renal failure,ARF)发生、发展的主要原因。研究表明,细胞焦亡和坏死是导致IRI后肾小管细胞死亡的主要途径。FOXO3a是多种细胞活动的关键调节因子,如细胞周期停滞、氧化清除、细胞增殖、存活和死亡。FOXO3a下游存在一种具有caspase募集结构域的凋亡抑制因子(apoptosis repressor with caspase recruitment domain, ARC),可拮抗细胞死亡的内在和外在途径。而有研究证实,miR-155在IRI后人肾小管细胞系(HK-2细胞)中显著高表达,miR-155可以通过直接靶向抑制FOXO3a其下游蛋白ARC,上调炎性细胞因子caspase-1的表达从而促进肾小管细胞焦亡,而miR-155的敲低则导致caspase-1、IL-1β和IL-18水平降低,减弱HK-2细胞的焦亡。此外,有实验研究显示,在IRI诱导的ARF的大鼠模型中,miR-155的表达显著上调,并通过TCF4/Wnt/β-catenin信号通路靶向调节肾小管上皮细胞的凋亡[27]。这说明miR-155在肾小管细胞焦亡的发病机制中起关键作用。

3.miR-155对足细胞焦亡的影响:炎性小体NLRP1的旁系同源物NLRP1b在小鼠体内可以通过激活caspase-1/pro-IL-1β/pro-IL-18通路参与焦亡,而近年来有研究显示,miRNA可以靶向调节NLRP1的表达从而调控细胞焦亡的过程,在足细胞焦亡中,miR-155-5p和miR-155-3p作为miR-155的2个剪接体能够分别识别IL-18BP的3′UTR区上的多个位点和IL-18BP CDS区上的位点,这提示miR-155-5p和miR-155-3p能够通过直接结合IL-18BP的方式抑制IL-18BP的功能,从而启动IL-18信号通路,进一步调控caspase-1、IL-1β、IL-18等焦亡关键因子的表达,miR-155的过表达可以启动miR-155↑→IL-18BP↓→caspase-1↑→GSDMD、IL-1β、IL-18↑→细胞焦亡↑的经典信号通路,且足细胞焦亡随着miR-155的降低而缓解[28]。TGF-β1可以通过miR-155信号通路抑制nephrin蛋白表达,放大desmin和caspase-9等蛋白表达,抑制miR-155的表达可以减轻TGF-β1对足细胞的影响从而缓解足细胞的凋亡。因此,miR-155在足细胞焦亡的过程中发挥重要的作用。

五、miR-155对LN的影响

miRNA是基因表达的重要调节因子,在表观遗传调控因子中,miRNA已成为负调控靶基因的内源性分子。已发现miRNA在肾小球细胞群(足细胞、肾小球内皮细胞等)的失调所导致的细胞特异性反应和损伤参与多种肾小球疾病,如LN、IgA肾病和糖尿病肾病等。有研究表明,miR-155的过度表达可以通过下调CXCR5-ERK信号通路抑制B细胞趋化因子诱导的LN中肾小球系膜细胞的增殖和TGF-β1的产生,在小鼠模型的体内实验中,miR-155的敲除促进了足细胞裂孔蛋白nephrin和P-cadherin的表达并减轻了糖尿病肾病的肾损伤,这表明miR-155可作为肾小球疾病的新靶点。在构建miR-155-/-Faslpr/lpr模型小鼠实验中,miR-155的敲除显著缓解了LN症状的严重程度、肾小球部位IgG、IgM等免疫复合物的沉积及一系列炎性反应。有研究表明,miR-155作为天然的特异性免疫反应调节剂,在SLE合并LN患者的淋巴细胞、树突状细胞和巨噬细胞中的表达显著升高,miR-155在LN患者血清中的表达水平也明显高于正常人群,且与SLE的活动度呈正相关。因此,miR-155可以成为新的LN活动度评估及预后判断的分子标志物。

综上所述,miR-155通过对细胞焦亡相关通路的调控从而参与到LN的致病过程中,细胞焦亡可以通过免疫细胞和肾脏固有细胞引起肾损伤,miR-155在细胞焦亡及LN中的作用已经不容小觑,其在细胞焦亡及LN中的机制有待于进一步研究。本文总结了miR-155在细胞焦亡中的负性调控作用,为LN的治疗及预后提供了新的靶点,降低miR-155在LN患者体内的表达或许可以延缓细胞焦亡从而改善LN的症状及预后,为LN的特异性治疗提供了新的方向。