脓毒症相关急性肾损伤的生物学标志物研究进展

李 茹 杜贤荣 杨晓宇 刘文操

脓毒症是机体对感染反应失调引起的危及生命的器官功能障碍[1]。急性肾损伤是脓毒症的严重并发症,随着其发生率及病死率的不断增加,每年影响世界数百万人,导致30%～60%的患者死亡[2]。同时使肾脏替代治疗使用率增加,机械通气、重症监护病房住院时间延长,增加医疗费用并且消耗医疗资源。因此,寻找脓毒症相关急性肾损伤(sepsis-associated acute kidney injury,S-AKI)早期敏感的生物学标志物至关重要;由于S-AKI机制尚不明确,常规的血肌酐和尿量在诊断和评估肾功能时存在局限性,使得S-AKI患者病死率居高不下。近年来,随着分子生物学技术及基因工程的蓬勃发展,一些生物学标志物在早期诊断肾损伤方面显示出较高的特异性和敏感度,在S-AKI的诊疗方面有很大潜力。

一、S-AKI诊断现状

根据2012年改善全球肾脏病预后组织(Kidney Disease: Improving Global Outcomes, KDIGO)对AKI诊断标准[3]:①48h内肾功能突然下降,血肌酐绝对值升高≥26.5μmol/L(0.3mg/dl);②血肌酐增加≥基础值的1.5倍;③尿量<0.5ml/(kg·h),持续时间>6h。当符合标准两项及以上时,急性肾损伤诊断成立。目前仍然是依据血肌酐和尿量的变化来评估肾功能,然而只有肾小球滤过率降低至正常值的约30%时,血肌酐才会明显升高,因此,以血肌酐来间接评估肾功能的方法存在滞后性[4];再者血肌酐水平受许多因素影响,包括饮食、药物治疗、肌肉质量、性别和种族等差异,这可能导致严重低估肾功能障碍的程度,延误治疗时机。尿量同样作为急性肾损伤的标志,缺乏特异性和敏感度,可能是因为少尿是机体对紧张性刺激的一种适当的生理反应,且尿量可能在严重的肾损伤时才出现减少[5]。因此,以肌酐和尿量为标准的AKI诊断缺乏理想的敏感度和特异性。

二、新型生物学标志物

由于近年来对S-AKI病理生理、分子机制的不断探索和分子生物学技术的快速发展,发现了多种S-AKI早期诊断和监测的敏感又特异的新型生物学标志物,这些生物学标志物不但可以在血肌酐升高之前对S-AKI的诊断提供线索,而且还能帮助了解肾损伤的部位和程度,以及预测AKI治疗的效果及预后,为急性肾损伤的治疗带来了希望。

1.胱抑素C(cystatin C, CysC):CysC由有核细胞产生,经肾小球过滤,然后主要在近端肾小管细胞中被重吸收和分解代谢。其在预测老年患者的心血管事件和病死率方面优于血肌酐。因此,与血肌酐比较,CysC是更可靠的肾功能标志物;然而它容易受到年龄、大剂量皮质类固醇、甲状腺功能状况、炎症和恶性肿瘤的影响,需要大量临床数据深入研究[6]。由于血肌酐浓度的变化有一定的局限性,尤其是在危重症患者临床病程的后期,尿液中CysC浓度似乎不受S-AKI患者肌酐水平的影响,因此,CysC在S-AKI早期诊断和评估危重症患者病情进展方面具有巨大潜力。

2.肾损伤因子-1:肾损伤因子-1(kidney injury molecule-1, KIM-1)是一种跨膜糖蛋白,包含细胞外免疫球蛋白和黏蛋白结构域,在正常健康人的肾脏中低表达。然而其在缺血再灌注损伤后上调,特别是在肾损伤48h后近端肾小管上皮细胞中明显升高,这提示KIM-1似乎是S-AKI的高度敏感的标志物[7]。研究证实,当肾小管进行性损伤时血清KIM-1持续升高,其可能增加慢性肾脏疾病发展的风险,而尿液KIM-1也显示出与肾损伤具有一定的相关性[8]。因此,KIM-1是急性肾小管损伤的早期敏感指标。

3.中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白:中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase associated lipids transport proteins, NGAL)是脂质载体蛋白超家族的一种糖蛋白,主要在中性粒细胞表面表达,同时在其他细胞类型(如肾细胞和肝细胞)中也少量存在,是近年来研究较为热门的方向。在正常情况下,NGAL通过肾小球过滤,并在近端小管被重吸收。如果肾小管系统在缺血性或肾毒性肾损伤期间受到影响,NGAL的表达会迅速上调,因此,在肾损伤发作后3h,即可在尿液中检测到NGAL。研究表明,与促炎性细胞因子比较,血浆NGAL水平似乎与中性粒细胞计数有更强的相关性,所以在全身炎性反应患者中,由于中性粒细胞减少,仍可能出现较低的血浆NGAL水平。如果肾小管系统受到影响,伴有中性粒细胞减少症的AKI患者的尿NGAL水平也可能显著升高,因此,在炎症活动或肾损伤时NGAL水平皆会出现波动[9]。

近年来,NGAL与铁调素(铁稳态的主要调节因子)一起被发现在S-AKI预后不良的患者中明显升高,提示NGAL结合铁载体在抗菌作用方面具有潜在的研究价值。有研究表明,尿NGAL水平升高反映了近端小管功能障碍或损伤导致滤过NGAL重吸收减少,而在S-AKI期间,其表达也在肾小管系统中上调,并发现其敏感度优于CysC和KIM-1等生物学标志物,是S-AKI的独立危险因素,对S-AKI早期诊断有重要的价值[10]。

4.可溶性髓样细胞触发受体-1:髓样细胞1所表达的触发受体(triggering receptor expressed on myeloid cells-1,TREM-1)是一种先天性免疫性受体,与无菌性和非无菌性炎症疾病中的炎症密切相关。该受体的2种亚型分别为膜型(mTREM-1)和可溶性型(sTREM-1),已经在几种细菌性疾病和脓毒症的免疫性疾病机制中进行了大量研究。由于炎症是几种细菌感染的结果,因此,抑制该受体被认为是治疗脓毒症的可靠方法[11]。在正常人尿液中,sTREM-1水平极低,难以检测出来,而在脓毒症患者的尿液中可以被检测到,所以尿液中sTREM-1水平成为目前AKI早期诊断的热门研究方向。有研究者对脓毒症患者尿液中的sTREM-1水平进行动态监测及分析,提示尿液sTREM-1水平是脓毒症患者发生AKI的独立危险因素[12]。

5.肝型脂肪酸结合蛋白:肝型脂肪酸结合蛋白(liver-type fatty acid binding protein, L-FABP)是一种相对分子质量为14kDa的胞质蛋白,主要在肝脏中表达,在肾脏、肠、胃和肺中也有少量表达[13]。有研究显示,尿液L-FABP水平在一些急性肾脏疾病,如缺血再灌注损伤/低灌注、脓毒症和肾毒性药物诱导的AKI中升高,提示尿液L-FABP可用于早期诊断监测S-AKI[14]。更有实验表明,尿液L-FABP与AKI中蛋白质重吸收受损密切相关,因此,尿液L-FABP被认为是肾小管损伤的特异性标志物[15]。导致L-FABP尿排泄增加的确切病理生理途径尚不明确,需要进一步探索。

6.组织金属蛋白酶抑制剂-2和胰岛素样生长因子结合蛋白-7:肾小管细胞在AKI发生前会出现应激反应进行自我保护,即分泌一种阻滞蛋白使细胞周期停止,然而在AKI期间持续的细胞周期停滞可能导致适应性修复不良,最终导致纤维化。研究证实,胰岛素样生长因子结合蛋白-7(insulin-likegrowth factor binding protein-7, IGFBP-7)和组织金属蛋白酶抑制剂-2(insulin-likegrowth factor binding protein-2, IGFBP-2)通过阻断周期蛋白依赖性蛋白激酶复合物的作用,参与了G1细胞周期阻滞的细胞应激早期阶段,已被确定为早期检测肾损伤高度敏感和特异的生物学标志物[16]。IGFBP-7联合TIMP-2在心脏手术后人群中的临床应用也得到了进一步的研究[17]。有研究发现,TIMP-2联合IGFBP-7对中、重度AKI的敏感度为81.2%,该组合对AKI的早期诊断优于NGAL、KIM-1、L-FABP等已知的生物学标志物[18]。因此,TIMP-2联合IGFBP-7在脓毒症相关AKI的早期诊断中具有至关重要的作用。

7.可溶性δ样蛋白1(soluble delta-like 1,sDLL1):与血管内皮细胞功能障碍相关的血管渗漏是脓毒症的标志,而血管内皮完整性降低的原因是病原体成分、炎症相关宿主因子、血管内皮细胞和活化循环免疫细胞相互作用的复杂反应[19]。内皮功能障碍是S-AKI的重要机制,内皮细胞受到炎症刺激时产生一氧化碳,导致血管扩张、自我调节失调和内皮功能障碍,内皮细胞之间的分泌蛋白和黏附因子相互作用以及内皮细胞和白细胞之间允许白细胞通过的复杂相互作用介导,从而导致肾小管内皮细胞功能障碍,最后形成AKI[20]。因此,S-AKI的发展与血管内皮完整性密切相关。有研究发现,调节血管内皮完整性的一个信号通路是Notch级联,其通过Notch配体与其相应的Notch受体的结合而被激活[21]。有研究显示,Notch配体的可溶形式sDLL1在脓毒症患者的血液中含量很高,这为S-AKI患者早期诊断提供了新的方向。

为了研究感染相关患者sDLL1的影响,Moll等[22]在细胞迁移和侵袭实验中用血液培养的人脐静脉细胞进行研究,由于sDLL1刺激可诱导内皮细胞激活进而使内皮细胞紧密结构和屏障功能丧失,因此,脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激的人脐静脉细胞激活和内皮细胞通透性的增加,其可以通过阻断与sDLL1受体结合从而使Notch信号转导显著降低,证实了LPS介导的内皮功能障碍中的级联反应,结果表明,在细菌感染和LPS识别过程中,sDLL1激活的Notch信号与血管通透性相关。为进一步证实sDLL1在脓毒症患者中的变化,有研究者进行了一项前瞻性实验,结果表明,在脓毒症患者中,血液中可溶性Notch配体sDLL1的升高特别明显[23]。另有研究确定了sDLL1对AKI检测的预测价值,使其成为重症监护AKI患者的潜在生物学标志物[24]。目前AKI患者尿液中sDLL1的相关研究较少,无确切证据表明尿液中sDLL1与AKI的相关性,还需开展进一步研究予以证实。

8.外泌体:健康人和患有不同疾病的人释放到循环/体液中的外泌体成分(蛋白和RNA)是不同的,它是由原核细胞和真核细胞释放的纳米大小的包被有双层结构的小囊泡,富含多种生物活性物质,如蛋白质、核苷酸和脂质[25]。外泌体广泛存在于各种体液和细胞培养上清液中,其通过这些活性成分向靶细胞穿梭从而介导机体的生理和病理过程[26]。有研究表明,多种细胞来源的外泌体在急性和慢性肾脏疾病中可以发挥有益的作用,特别是来源于间充质干细胞的外泌体在临床试验中对肾病的预防和治疗有显著疗效。

研究表明,外泌体中的微小RNA(microRNA,miRNA)可以反映损伤和纤维化状态,如miR-9a、miR-16、miR-200a和miR-141的释放[27]。尿液是外泌体研究中最常用的生物体液,尿液中外泌体的研究成为近几年的热门话题;还有其他如Na+/H+交换器异构体3也有望成为S-AKI相关的外泌体生物学标志物[28]。

9.非编码RNA:超过80%的人类基因组被转录成没有蛋白质编码能力的RNA,这种功能基因组转录物被称为非编码RNA。非编码RNA主要包括miRNA、长非编码RNA、环状RNA、小核仁RNA、P元件诱导的睾丸肥大相关RNA和转移RNA。不同的非编码RNA通过特定的机制发挥作用,越来越多的证据表明,非编码RNA在AKI中起重要作用。然而,非编码RNA调节AKI炎症相关基因表达的具体机制尚未完全阐明。

外泌体中包含的miRNA对S-AKI的早期诊断具有一定的价值,如外泌体miR-19b-3p(可调节炎性反应);研究发现,LPS诱导的AKI动物模型中肾小管上皮细胞外泌体miR-19b-3p比对照组显著增加了59.7倍,可作为S-AKI潜在的生物学标志物[29]。Ji等[30]研究表明,miR-320-3p是S-AKI患儿死亡的独立危险因素;还有研究表明,尿液中miR-452的增加可能是脓毒症患者早期检测AKI的有效生物学标志物[31]。

三、脓毒症相关急性肾损伤研究的局限性及展望

本研究所涉及的新型生物学标志物,包括TIMP-2联合IGFBP-7、NGAL、KIM-1和CysC等,可以使用常规诊断测定法进行测量,从而在短的周转时间(少于1h)内提供准确的结果,但仍需进一步研究来证实这些生物学标志物的敏感度和特异性。但外泌体因其种类繁多,如蛋白和核酸测量较为复杂,检查项目繁多且技术要求高,加之费用高昂,不适用于基层单位早期诊断S-AKI。总之,由于受当前技术要求的限制,研究者致力于开发更快速、有效且实用的方法。

S-AKI的早期诊断和有效治疗是降低患者病死率的关键。然而目前使用的生物学标志物(脓毒症:降钙素原、乳酸清除率、C反应蛋白;AKI:血肌酐、尿量)显示了关于脓毒症和AKI的诊断和预后的局限性,因此,寻找新的生物学标志物迫在眉睫。尽管大多数AKI生物学标志物提供了关于肾小管系统损伤有价值的信息,然而监测血清和尿液外泌体如非编码RNA等可以出现更加精准、敏感的信息,更可靠地用于评估涉及肾小球和肾小管源性肾损伤的整体肾损伤。此外,这些标志物的增加可以指导开始肾脏替代治疗的时机,从而有效减轻肾损伤并改善S-AKI的预后,因此可以为S-AKI的早期诊断和治疗提供保障。新型生物学标志物CysC、KIM-1、NGAL、sTREM-1、L-FABP、TIMP-2和IGFBP-7、sDLL1、外泌体、非编码RNA提供了一种用于监测炎症状况且非侵入性的检测指标,由于S-AKI是一种异质性的临床综合征,单独测量单一标志物不足以达到准确诊断和监测的目的。因此,涉及各种血清和尿液生物学标志物的多标志物方法和临床参数的联合应该应用于S-AKI的早期诊断。