中医药治疗在4-乙烯基环己烯二环氧化物诱导围绝经期动物模型相关疾病中的应用※

陈颖棋 刘保君 宓轶群 徐世芬 李珊珊△

(1.上海中医药大学针灸推拿学院2021级博士研究生，上海 201203；2.上海中医药大学附属市中医医院针灸科，上海 200071)

围绝经期是每位女性生殖衰老的必经阶段，自生育期的规律月经逐渐过渡到永久性无月经即绝经状态[1]。围绝经期的本质是卵巢功能衰竭，卵巢内储备的始基卵泡减少到阈值以下，进而生殖激素水平波动变化，并表现为月经紊乱、生育能力下降、潮热、情绪不稳定、睡眠障碍等绝经的一系列临床症状，患各种慢性疾病的风险逐渐升高[2]。围绝经期综合征症状可迁延数年，给患者生活和工作造成极大的困扰，严重危害女性的身心健康，对围绝经期相关疾病的研究成为社会发展的迫切需要[3]。

合适的围绝经期动物模型是开展围绝经期综合征及远期疾病相关研究的重要前提。根据不同的动物造模方法可大致分为自然老化的病因模型，摘除或部分摘除卵巢(去势)和酒精损伤卵巢的病理模型，以及去势后加以药物或施以行为致动物出现某种特定的围绝经期综合征症状的病症结合模型[4]，其中，4-乙烯基环己烯二环氧化物(VCD)诱导的卵巢早衰(POF)动物模型与人类生殖内分泌和组织学变化更为相似。此外，还有射线疗法损伤卵巢模型、药物诱导模型和免疫模型等应用相对较少的围绝经期动物模型[5]，这些造模方法侧重不同的病因学，仅适用于某些实验研究，具有一定的局限性。VCD给药模拟卵巢衰竭模型副作用小、给药方便、经济高效，保留卵巢组织的完整性，更符合人类从绝经前期到围绝经期，再到绝经后的过程，因此成为目前较为理想的围绝经期动物模型[5-8]，并得到了广泛的应用。本文针对VCD动物模型的构建与应用及对中药治疗VCD围绝经期动物模型相关疾病的进展进行详细阐述，以期为围绝经期动物实验研究提供理论支持与参考依据。

1 VCD诱导卵巢衰竭模型的构建

VCD是工业化合物4-乙烯-1-环己烯(VCH)的环氧代谢物，通常作为汽车轮胎、杀虫剂、增塑剂和阻燃剂等化学合成物的副产物被释放到环境中，可对人体造成健康危害[9-11]。VCD最早在1994年被列入第七次致癌物质年度报告名单中，证实其对啮齿类动物(大鼠和小鼠)有致癌性，可引起雌性小鼠的卵巢肿瘤[12]。VCD是VCH卵毒性的主要活性形式[11,13]，体内和体外实验表明VCD可能是通过增加凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤-2- 细胞死亡拮抗蛋白(Bad)的表达及Bax/B细胞淋巴瘤-长亚型蛋白(Bcl-xl)在线粒体膜上的比例，诱导细胞色素C(Cyt C)从线粒体向细胞质扩散，放大凋亡信号，激活并增加半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的表达和活性，引发Caspase级联反应，进而加速窦前小卵泡闭锁(凋亡)[14-16]。

VCD诱导加速卵巢衰竭模型可以选择成年、青春期或老年雌性小鼠或大鼠作为造模的动物，主要品系有C57BL/6、SD、B6C3F1和Fischer 344[8,17-19]。VCD诱导围绝经期动物模型的成功构建与给药途径、剂量及持续时间密切相关，通常以玉米油或芝麻油作为VCD的溶剂，采用皮下或腹腔注射中高剂量浓度(80 mg/kg或160 mg/kg)的VCD进行连续(15天)给药，给药结束后30天内是研究卵泡变化及给予干预措施的窗口期，30～60天是研究围绝经期相关器官疾病的最佳时期[20-22]。

2 VCD诱导围绝经期相关疾病动物模型的应用

2.1 心血管疾病 雌激素有助于调节脂质代谢，降低血液黏稠度，保护血管内皮细胞，抑制炎症因子的释放，在预防心血管疾病中发挥重要作用[23]。围绝经期女性体内雌激素水平降低，增加了患心血管疾病的风险。

VCD诱导卵巢衰竭模型能模拟从围绝经期逐渐过渡到绝经期体内性激素的生理变化，同时把生殖衰老和年龄因素独立开来，可以在任何起点对老鼠进行VCD干预，是研究围绝经期心血管疾病易感性合适的临床前啮齿动物模型[24]。Fernandes R[25]发现给雌性小鼠注射VCD后，小鼠在第60天和第120天时表现出发情周期中断和无发情周期，这种逐渐过渡到围绝经期状态模拟了体内激素环境的生理变化，避免了使用去势模型出现的雌激素突然丧失对研究围绝经期过渡到绝经期阶段心脏功能变化的影响，包括心肌细胞分子和雌激素受体调节的变化。

2.2 绝经后骨质疏松 雌激素参与人体的骨代谢，调节成骨细胞和破骨细胞的活动，绝经后雌激素缺乏会抑制骨的形成，造成骨丢失与骨强度降低[26]，进而演变成骨质疏松。与其他绝经后骨质疏松模型相比，VCD诱导的卵巢衰竭模型更符合人类自然绝经后骨质疏松情况。

Wright L E等[27]将小鼠去势模型与VCD诱导模型对骨骼的影响进行比较发现，虽然两种造模方法均可导致骨质疏松，但VCD模型组较去势模型组骨丢失缓慢，且血浆中的雄烯二酮水平明显高于去势模型小鼠，因此，他们认为雄烯二酮是骨质丢失较慢的主要原因。Lukefahr A L等[28]在保留完整下丘脑-垂体-卵巢轴的前提下，利用VCD诱导SD雌性大鼠，观察围绝经期激素变化与骨密度之间的关系，结果显示卵泡刺激素(FSH)、抑制素A的水平与骨密度损失关系密切，其中抑制素A最可能是介导骨丢失过程的关键激素。Kalam A等[29]通过VCD诱导瑞士品系白化雌性小鼠绝经的模型证明，抗骨质疏松药物雷洛昔芬可以预防和减轻绝经后乳腺癌治疗药物来曲唑引起的骨质流失。

2.3 围绝经期动脉粥样硬化 研究表明，雌激素-去乙酰化酶(SIRT1)-内皮型一氧化氮合酶(eNOS)通路在卵巢衰竭引起的动脉老化与动脉粥样硬化方面发挥关键作用[30-31]。围绝经期女性体内雌激素水平降低，可导致血管舒缩功能失调和血脂调节作用下降，以及脂质在大中血管内膜沉积，加速动脉粥样硬化的发生和发展。VCD诱导的卵泡耗竭模型与卵巢切除模型(OVX)联合用于低密度脂蛋白受体缺陷(LDLR-/-)小鼠的动脉粥样硬化研究发现，在给予高胆固醇饮食120天后再给予外源性雌二醇(E2)处理，结果显示VCD+E2组无名动脉和主动脉动脉的粥样硬化病变区面积均小于OVX+E2组，说明在动脉粥样硬化病变发展过程中，卵巢的内分泌状态会影响外源性E2的效应[32]，而VCD模型给研究围绝经期卵巢功能状态与动脉粥样硬化发生发展这两者之间的关系提供了机会。

2.4 围绝经期阿尔兹海默病(AD) 内源性雌激素受体α(ERα)和受体β(ERβ)分布在下丘脑、杏仁核及脑海马、皮层和嗅叶中，均与认知功能相关[33]。研究表明，E2水平缺乏会导致淀粉样蛋白β(Aβ)和大脑皮质中淀粉样前体蛋白(APP)的升高，继而失去神经保护作用，围绝经期雌激素与雌激素受体反应网络的广泛波动变化是增加女性大脑对AD易感性的基础。有学者认为，低剂量VCD诱导的加速卵巢功能衰竭(AOF)模型不会对除了卵巢以外的器官及组织产生影响，也不会透过血脑屏障[34]。因此，利用该模型验证围绝经期对AD影响的关键分子机制、激素替代疗法的临床疗效以及前期从OVX模型得出的结果具有重要意义[35]。Golub M S等[36]首次成功使用VCD在APPswe2576转基因小鼠中诱导卵巢萎缩，并用野生型(WT)鼠作为对照纵向研究AD认知功能，由于这些小鼠的存活率低(30%)，因此无法有效评估雌激素对水迷宫结果的影响，也未发现有卵巢萎缩或雌激素治疗的影响。

2.5 其他围绝经期继发疾病 国内学者主要把VCD模型用于研究早发性卵巢功能不全，国外学者还将VCD模型运用到肿瘤[37-38]、糖尿病肾病[39]、绝经后癫痫[40]等研究中，都显示VCD模型造模成功。

3 VCD诱导围绝经期动物模型在中医药治疗的应用

3.1 中药治疗VCD诱导的围绝经期动物模型相关疾病 Zhao F等[41]利用不同浓度更年春方(GNC)汤剂给VCD雌性SD大鼠灌胃30天后发现，高剂量GNC组显著增加了VCD大鼠的卵巢指数，并维持原始卵泡和初级卵泡的数量，显著增加卵巢蛋白激酶B(Akt)磷酸化和下游FOXO3a的表达，促凋亡蛋白表达显著降低，说明GNC可以通过激活Akt信号通路和减少细胞凋亡来保护卵巢储备而免受VCD诱导产生的卵毒性。Li M等[42]证明了护阳养坤方(HYYKF)联合胚胎干细胞移植的方法可通过抑制转化生子因子β1(TGF-β1)/TGF-β活化激酶1(TAK1)通路的表达促进卵泡发育，进而改善VCD诱导的POF小鼠的卵巢功能，疗效优于单独使用HYYKF或胚胎干细胞移植。Nam E Y等[43]采用VCD体外诱导中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)和人类卵巢颗粒肿瘤细胞(COV434)制备细胞毒性模型，证实了吴茱萸提取物可通过激活Akt相关通路拮抗VCD的卵毒性，有助于预防POF或环境因素引起的原因不明的不孕症。Kim D等[44]研究显示，包含菟丝子、续断和吴茱萸的汤药(STH-KP17001)STH-KP17001可改善VCD诱导AOF模型引起的抑郁和焦虑行为，稳定小鼠的皮质醇水平，并恢复小鼠额叶皮层中脑源性神经营养因子的表达。Wang Y等[45]通过12周龄ICR雌性小鼠VCD模型证实，杏仁核基底外侧复合体(BLA)中5-羟色胺受体1A(5-HT1Ar)等下调导致5-HT缺乏是焦虑行为形成的原因，而E2改善围绝经期和绝经后焦虑可能是通过促进5-HT实现的。VCD对卵巢高度的选择性则有利于围绝经期焦虑、抑郁相关研究中中枢及外周机制相关指标的观察，进而得出更可靠的结果。

雌激素作为女性体内一种重要的激素，参与了全身的糖脂代谢，在预防心血管疾病、糖尿病及高血压等方面发挥重要作用。Xing X等[46]利用高脂饮食喂养VCD给药的Wistar大鼠诱导围绝经期高血脂症，研究中药复方丹知青娥方(DZQE)对围绝经期脂质代谢的影响，经过给大鼠不同浓度的DZQE灌胃给药8周后发现，DZQE组血清E2、睾酮(T)浓度升高，FSH、黄体生成激素(LH)浓度降低；血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)浓度降低，表明DZQE可以改善围绝经期的卵巢功能和脂质代谢。相比于高脂饮食大鼠，单纯VCD注射大鼠体内的游离脂肪酸和TC明显增加[47]，证明卵巢功能减退加速了代谢综合征的发生和发展，可见VCD模型是研究围绝经期继发代谢综合征的理想动物模型。

中药本身不是激素，但是具有类激素的作用。中药与激素替代疗法联合治疗POF不仅可以提高临床有效率，还可以降低激素治疗引起的各种不良反应的发生率，长期疗效明显，具有较高的临床应用价值[48]。

3.2 针灸治疗VCD诱导的围绝经期动物模型相关疾病 针灸治疗VCD诱导的POF研究报道较少，有效证据不足。有学者对电针治疗POF进行病例序列研究给出初步探索性结果，认为电针疗法在恢复POF患者的月经周期、调整和改善患者激素水平方面具有较大的潜力[49]。王伟明等[50]采用VCD诱导POF大鼠模型，采用低频电针刺激中髎穴和天枢穴，结果显示可以抑制卵巢组织胰岛素样生长因子1型受体(IGF-1R)mRNA的表达，进而改善卵巢功能。其他利用穴位埋线或手针的方法治疗雷公藤多苷和环磷酰胺诱导的POF模型研究结果显示，对改善POF鼠的激素水平和发情周期效果良好[51-52]。

4 结语

VCD是一种具有卵毒性的工业化合物，体外细胞培养试验或实验鼠体内实验均已证明VCD可以特异性杀死原始卵泡和初级卵泡，破坏卵巢储备并导致POF。VCD存在显著的剂量依赖性，大剂量连续给药对卵巢的破坏程度严重，给关于围绝经期综合征症状表现、激素水平变化与卵巢衰竭程度关系的研究提供良好条件。VCD模型雌激素水平有明显的剂量和时间效应，故此模型的另一个优点是允许纵向研究激素水平与衰老之间的关系而不受动物年龄的影响。此外，VCD不会对除了卵巢以外的器官和组织产生明显的毒性作用，同时该模型还保存完整的卵巢组织，高度模拟了人类围绝经期阶段激素水平的变化情况及围绝经期综合征症状如焦虑、抑郁、潮热等，是探索围绝经期继发的慢性疾病如冠心病、高血压和糖尿病肾病等发病机制的优势模型。

VCD模型可变的窗口期和VCD效应的剂量依赖性表明，这种造模方法相比其他获得性POF鼠的模型更具优势。现代技术可以跟踪卵巢和激素水平的逐渐变化，并将卵巢的变化与其他组织器官联系起来。故VCD诱导的模型不仅可以研究POF的疾病状态，还可以研究围绝经期生理变化及相关并发症。虽然造模周期相对较长，但众多文献实践证明VCD诱导POF模型具有稳定性好、成功率高、安全有效的优点，可以作为探索一系列中医药治疗临床前生殖疾病的手段而被广泛应用。