γ-聚谷氨酸在冷冻食品中的应用及其抗冻机理的研究进展

王 慧，何宜能，张伟杰，沈黄晨，李申莹，孙弋歌，雷 鹏，徐 虹*，王 瑞*

（南京工业大学食品与轻工学院，材料化学工程国家重点实验室，江苏 南京 211816）

低温冷链技术是一种广泛采用的长期贮存食物方法，其通过接近或低于冰点的温度处理食品，来延长食品的保质期[1]。然而，食品在冷冻贮存过程中通常会发生品质的劣变，主要分为物理变化（汁液流失、干耗、质构破坏、比热容、热导率等）和化学变化（蛋白质变性和聚集、脂质氧化、内源酶活化、风味变差、色泽变化等），其中制约产品品质的关键因素是冰晶的生长和重结晶的形成[2]。为了解决此类问题，各种抗冻技术应运而生，添加抗冻剂作为其中的一种方法，为庞大的食品工业领域中抗冻技术的探索提供了更加开阔的思路[3-5]。

传统的商业抗冻剂多为糖类、多聚磷酸盐类、醇类及其复配物[6-8]。蔗糖等高甜度、高热量的糖类抗冻剂不利于肥胖症患者及糖尿病人的食用，制约了其使用范围；复合磷酸盐的添加受到了严格限制，添加量偏高不仅会有苦涩味，也会影响人体对钙质的吸收，甚至会加重高血压及慢性肾病者的症状[7]；糖醇类和多聚磷酸盐类抗冻剂虽然可以使冰晶细小化，但是不能有效控制温度反复波动过程中重结晶的形成，从而对食品质地和空间结构造成破坏[9]。近年来，随着消费结构的升级和健康饮食理念的推广，“减糖、减盐、减油”的理念逐渐深入人心，消费者对于“健康食品”的需求不断增加。为了实现食品产业逐步提升到食品可持续供给与营养健康保障的更高层次，研发绿色、健康、环保的抗冻剂具有重要的经济效益和现实意义。

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，γ-PGA）又称纳豆菌胶、多聚谷氨酸，最早在纳豆（日本传统食品）中发现[10]，具有优异的益生功能和食品安全性，同时在日本和韩国等国家被列入食品添加剂目录[11]，在促进矿物质吸收、减盐、抗冻等领域得到广泛应用，基于产品在食品安全和营养健康领域广阔的应用潜力，γ-PGA原料近年来实现了工业化生产，目前主要通过微生物发酵法生产，该方法具有生产过程可控、产品分子质量多元化和生物安全性高等优势[12-13]。作为一种新型的抗冻剂，γ-PGA最大的特点是通过氢键与水分子连接，吸附在冰层表面，限制了冻藏过程水分子的流动，抑制了冰晶的生长和重结晶的形成。另外γ-PGA还具有益生功能，对人体具有保健作用：如促进Ca2+的吸收，有助于预防骨质疏松症[14]；促进小肠对生理活性物质（如维生素、多酚或类胡萝卜素）的摄取[15]；刺激体内针对病毒抗原的免疫反应，增强人体免疫功能[16]；还能发挥降低胆固醇、降血糖、降血脂等功效[17-20]，这些有益功能促进了γ-PGA在食品功能因子领域的应用，为推动以生物技术和生命科学为先导的健康产业的发展提供了研究热点。本文综述γ-PGA的应用现状，总结其抗冻机制，旨在为γ-PGA作为一种新型抗冻剂在食品科学等领域的研究和应用提供理论依据。

1 γ-PGA的结构和组成

γ-PGA（图1）是由D-谷氨酸和L-谷氨酸组成的多聚酰胺，通过γ-酰胺键连接而成[21-24]，是一种阴离子型多肽聚合物。γ-PGA分子链上含有大量的羧基，可在分子内部或分子之间形成氢键，这些氢键的形成不仅提高了γ-PGA的水溶性和保水性[10]，还能够有效束缚冻藏过程中水分的流动，阻止冻结过程中冰晶的生长以及在融化过程中重结晶的形成[25]。此外，γ-PGA具有独特二级结构包括β-折叠（50.3%）、β-转角（0.5%）、α-螺旋（18.5%）和无规卷曲（30.7%），其丰富的α-螺旋和β-折叠也是水分子结合和抑制冰晶形成的主要原因[26-28]。最后，作为食品功能原料，其降解产物为氨基酸，有效保障了生物安全性[29]。

图1 γ-PGA结构式（n＞100）Fig.1 Structural formula of γ-PGA (n ＞ 100)

γ-PGA的抗冻功能与其分子质量密切相关[30]，其分子质量主要分布在10～2 000 kDa之间。Mitsuiki[31]、Shih[32]等应用差示扫描量热技术测定了不同分子质量γ-PGA的抗冻活性，发现随分子质量的增加其抗冻活性呈下降趋势，且分子质量低于20 kDaγ-PGA的抗冻活性明显高于公认的抗冻剂葡萄糖，在对深度冷冻敏感的酶或培养物的冷冻保藏中具有一定的应用前景[30-33]。高分子质量的γ-PGA具有较高的黏度，并且分子质量越大，黏性越高，持水性越强，将其添加到果汁和冰激凌等产品中还能够起到增稠剂和稳定剂的作用[34]，从而提高混合料液的黏度，增强产品的抗融性和保存的稳定性[35]。结合γ-PGA分子质量多元化所带来理化性质的差异，众多学者将其应用在不同领域，表1归纳了不同分子质量的γ-PGA及其衍生物的生理功能和应用，为新型食品冷冻工艺的发展提供了新的应用前景，尽管如此，目前关于γ-PGA分子质量与抗冻功效关联的深层机制尚不明确，有待进一步研究。

表1 γ-PGA及其衍生物的应用前景Table 1 Potential applications of γ-PGA and its derivatives

抗冻活性取决于对水分子、糖类和无机盐的固定活性[40-42]。γ-PGA聚合物链之间的氢键能够固定水、糖和无机盐等分子，使现有的分子相互作用（二硫键、氢键、疏水相互作用、离子相互作用）以及物理效应（例如吸附、空间位阻和水分迁移）复杂化，从而影响食品的质构、凝胶性和延伸性等[43-44]。另外，γ-PGA不仅能以水不溶性游离酸的形式存在，也可以通过与多种金属离子结合以可完全水溶的γ-PGA盐形式存在，这些γ-PGA盐也具有抗冷冻能力，其抗冻活性取决于γ-PGA盐中的阳离子，按Mg2+＞Ca2+＞Na+＞K+递减。Maeda[45]、Berthold[46]等发现γ-PGA盐高抗冻活性主要是由带电反离子通过库仑力来影响水的氢键网络结构；Shih等[32]也基于差示扫描量热和核磁共振技术得出了γ-PGA盐防冻活性是由于盐对水分子的高固定活性引起的，这种性质对食物还具有一定的低温保护作用[42]。除此之外，γ-PGA盐无味且易溶于水形成有黏弹性的弱凝胶，可以在食品、菌种以及酶的保存中得到广泛应用[47]。

2 γ-PGA抗冻机制

食品在冷冻过程中的关键步骤是晶体的形成，也是影响食品品质的关键因素。晶体的形成过程可以分为两个不同的阶段：结晶和再结晶[48]。结晶也分为两个关键步骤：成核和晶粒的生长。结晶是由成核引起的，成核即水分子结合成稳定的晶核形成有序的冰颗粒。晶核一旦形成，在结晶驱动力的作用下，促使晶核吸附周围的水分子形成冰晶并快速生长[49]。冰晶的形态对温度和过饱和度十分敏感，小冰晶具有更大的比表面积和更高的自由能，受热动力学效应影响，组织内水分子由小冰晶变成大冰晶，冰晶数量减少，表面能降低，从而发生重结晶。重结晶包括小冰晶的融化、大冰晶的生长和冰晶的融化[50]。冰晶的生长和重结晶的形成都会通过机械应力对组织和细胞造成损伤，引发一系列生化反应，最终导致食品品质的下降。

通过对大量γ-PGA抗冻作用的研究总结，针对γ-PGA的性质（吸水性、保水性、抗氧化性、交联性等），可以将其归纳为对食品内部水分、蛋白质、脂肪、糖类等主要组分的影响。γ-PGA的抗冻机理可总结如下。

2.1 “吸水-保水”抑制水分迁移

基于对γ-PGA的吸水性和保水性的研究，鞠蕾[51]、刘婷[52]等通过吸水试验发现γ-PGA在蒸馏水和生理盐水中的吸水倍数可达约200 g/g，比目前常用的保水剂PAM的吸水能力强1.7 倍，是一种天然的“保湿霜”，它的吸湿性和保湿效果与透明质酸相当[53]，且γ-PGA的浓度越高，结构越紧致，其保水性和吸水性就越强。这一性质可归因于分子链中游离的羧基，它可以通过氢键与水分子发生紧密结合，这种缔合作用抑制了水分的迁移。

食品中的水分由自由水、结合水和弱结合水组成[54]，水的状态影响了冰晶的生长/再生和冻融循环的结晶/再结晶过程。根据冻结期间的行为，食品中的水分分为可冷冻水和不可冷冻水，可冷冻水形成冰晶，进而影响冷冻食品的物理化学性质[55]。γ-PGA能促进食品中自由水向结合水和弱结合水的转化，抑制水分的迁移并缓解冰晶的形成。根据γ-PGA与冰晶结合模型推测γ-PGA与水分子的作用机制，如图2所示。带有羧基的γ-PGA分子通过氢键与水分子连接，吸附到冰层表面形成一层薄膜，使水分子运动受阻并避免了在低温下的重新定向，这种较大的“束缚力”不仅使冰晶间的结合更加紧密，还使冰晶更细小、更均匀。

图2 γ-PGA与冰晶结合模型图Fig.2 Model diagram of γ-PGA combined with ice crystal

谢新华等[55]通过应用低场核磁共振和X-射线衍射技术分析了加入γ-PGA后小麦淀粉中水分的状态和结晶结构，结果表明：γ-PGA有效减弱了弱结合水向自由水的转化，水分结合更加紧密，从而抑制了水分迁移，延缓了冰晶的形成；同时，γ-PGA降低了小麦淀粉凝胶的结晶度，抑制了冻融循环导致淀粉凝胶的重结晶现象。这一结果证实了γ-PGA的抗冻作用是通过与水分子以氢键结合来抑制水分的迁移，从而控制冰晶的生长和重结晶的形成。

2.2 “交联-修饰”调控冰晶

交联是大分子物质以共价键连接成网状或体型高分子的过程，能够增加聚合物的相对分子质量和稳定性，使之形成一个完整的聚合物网络结构[56]，起到提高体系凝胶特性和保护蛋白质结构的作用。γ-PGA的交联作用主要指分子链上的-NH2和-COOH能够自身或与其他高分子以氢键或静电相互作用进行交联，形成一种三维网络微结构聚合物——水凝胶。交联后的γ-PGA是一种高吸水性聚合物[57]，具有高水平的水化性和柔韧性，可以起到保护蛋白质的作用。

冷冻过程中会发生蛋白质冷冻变性，使原来稳定、紧密的结构被破坏，导致蛋白质功能和理化性质的改变。如图3所示，在冻结时，冰晶的形成引起结合水和蛋白质分子的结合状态被破坏，使蛋白质内部的共价键以及非共价键断裂，而重新形成的新键也已不在之前的位点；另一方面，在重结晶作用下，蛋白质分子因机械力而发生解聚，从有序空间结构向无序空间结构转化，进而导致蛋白质与水的结合能力降低并引发部分弱结合水向自由水转化[58]。此外，蛋白内部氨基酸残基之间氢键被破坏，引起疏水基团暴露并引发蛋白质分子间和其他分子内部的重新交联。所以如何调控冰晶的生长及抑制重结晶的形成对稳定冷冻食品品质至关重要。

图3 蛋白质冷冻凝聚变性模型Fig.3 Protein coagulation and denaturation model during frozen storage

γ-PGA对于冰晶的调控可归纳为以下几个方面：1）γ-PGA吸收水分形成一种胶体溶液，具有一定的黏性和较强的介稳性，通过氢键作用和静电相互作用吸附在冰晶表面形成一层薄膜，从而锁住水分[59]，提高食品中混合物料的黏性[60]并增强产品的抗融性和保存稳定性[61]。2）γ-PGA凝胶具有优异的吸水能力，比葡萄糖的水合作用还要强，可以引入更多的亲水性物质[62]。γ-PGA自身或与其他高分子物质（蛋白质、脂质、多糖等）发生交联反应形成三维网状结构，这种结构使自由水转化成结合水，游离的水分子被γ-PGA氢键超分子网络紧密结合，阻止系统的水分子成核，即使形成了一些小冰核，也可以避免过冷水加入冰核形成大冰晶。3）如图4所示，交联能够显著改变γ-PGA分子结构，使其具备高吸水性，形成为一种“多袋状”水凝胶，这种高亲和力使网络结构更加稳定，在冷冻过程中自身也可能发生分子聚集，引起食品质构特性的增强[63-64]。

图4 γ-PGA“多袋状”水凝胶模型Fig.4 “Multi-baggy” hydrogel model of γ-PGA

2.3 “静电-吸附”稳定体系

对于高蛋白冷冻食品，蛋白质的氧化、变性对品质有较大的影响，维持蛋白质高级结构构象稳定的作用力有多种，主要包括氢键、共价键、范德华力、静电作用力、范德华力、疏水作用力等[65]。这些作用力对于γ-PGA保护蛋白质空间结构、维持体系的稳定具有重要作用，可以归纳为以下两个方面：1）γ-PGA可充当氢键的供体和受体，与蛋白质等生物大分子物质形成带电胶团并吸附在大分子表面形成双层电子层，既存在静电引力，又存在静电斥力，与胶团范德华力共同作用以维持体系的稳定[66]。γ-PGA在一定范围内随浓度的升高，静电相互作用增加，疏水相互作用减弱，表现出较强的氢键，引起凝胶强度的升高和网络结构的稳定[64]。2）γ-PGA系统是一种“氢键超分子液体网络”，能够改变体系中水的结构，间接引起基团周围氢键结构的变化。时晓剑等[33]对γ-聚谷氨酸钠抗冻活性的机理进行了详细的阐述（图5）：每个水分子与周围4 个水分子通过氢键连接形成四面体结构，在冻结过程中，水分子四面体可形成冰晶。γ-聚谷氨酸钠在水溶液中发生电离，生成了-COO-和Na+，其静电力作用破坏了水的正四面体结构并束缚了一部分水分子，被束缚的水分子在-COO-和Na+周围形成水化层，水化层内部为不可冻结水，水化层外部为可冻结水。相对于葡萄糖和谷氨酸，γ-聚谷氨酸钠的解离度较大，Na+对水分子的束缚能力较强，故Na+形成的水化层中不可冻结水含量较多[42]。

2.4 “清除自由基-螯合金属离子”提高抗氧化能力

蛋白质是多种冷冻食品主要组成成分，蛋白质的状态决定了食品的品质，当受到含有氮氧化学元素的活性诱导物质（化学自由基和非自由基基团）的诱导时，会发生理化性质的变化（图6A）。这类诱导剂通过共价键的修饰会造成氨基酸侧链改变、巯基化合物含量增加、蛋白质降解以及溶解度降低等变化。如图6B所示，自由基和蛋白质侧链反应产生蛋白质自由基，之后和氧分子反应形成过氧化自由基。后者进一步攻击蛋白质中的氨基或亚氨基，形成羰基衍生物，此外，巯基的氧化可能会导致蛋白质内部或蛋白质之间二硫键交联的形成，使得蛋白质功能活性降低[67-69]。

图6 蛋白质氧化过程中理化性质的变化（A）和自由基诱导蛋白质氧化途径（B）Fig.6 Changes in physicochemical properties during protein oxidation (A)and free radical-induced protein oxidation pathway (B)

冻融过程类似于脱氧和复氧过程。冻融过程中产生的超氧阴离子使蛋白质的金属离子释放或还原，导致原有的氧化还原平衡被打破[70-71]。基于对γ-PGA抗氧化性质的研究，γ-PGA主要通过清除自由基、螯合金属离子的方式对蛋白质进行修饰[72]。γ-PGA还能够抑制脂质氧化和透明质酸的活性，减少细胞中氧自由基、氮自由基含量的增加[73]。Lee等[74-75]通过对γ-PGA抗氧化能力进行分析发现，1 mg/mLγ-PGA（分子质量400 kDa）对超氧阴离子自由基（O2-·）、羟自由基（·OH）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除率可分别达85.2%、94.1%、76.64%，对脂质氧化抑制活性高达96.0%。可以作为辅助抗氧化剂添加到高蛋白冷冻食品中应用。

γ-PGA可以阻止冻融和加热处理诱导的胞外蛋白变性，提高酶蛋白的稳定性和活性[65]。Jia Chunli等[76]分析了γ-PGA对于酵母细胞抗氧化能力的影响得出：1）γ-PGA作为一种良好的螯合剂，通过结合多种金属离子来阻止金属离子催化自由基，从而诱导酵母细胞抵御氧化；2）γ-PGA影响多种氧化还原酶来参与细胞抗氧化过程，如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、谷胱甘肽还原酶和超氧化物歧化酶[77]；3）γ-PGA可以阻止冻融和加热处理诱导的胞外蛋白变性，降低酵母细胞释放谷胱甘肽的浓度，提高了酶蛋白的稳定性和活性[78]。γ-PGA和细胞表面相互作用的理论模型如图7所示。

图7 γ-PGA和细胞表面相互作用的理论模型Fig.7 Theoretical model of γ-PGA interaction with cell surface

3 γ-PGA作为抗冻剂在食品工业中的应用

随着应用范围的不断扩大，γ-PGA在各类产品中不断展现出保水、增稠、抗氧化等性能，总结γ-PGA在各类产品中表现出的不同作用效果及机制（表2），有利于促进其在食品工业的发展潜力。作为一种新型抗冻剂，γ-PGA可以抑制水分迁移、修饰冰晶、提高抗氧化能力，γ-PGA另一个独特的优势是具有类似于微胶囊的包覆风味物质的性质。

表2 γ-PGA及其衍生物在食品工业中的应用Table 2 Applications of γ-PGA and its derivatives in food industry

3.1 在冷冻面团中的应用

冷冻面团技术已被广泛产业化应用，水是冷冻面团的主要成分，其行为和状态显著影响冷冻面团的质量。在面团的冷冻过程中，温度的波动促进了冰晶的生长，水分子与蛋白质之间的相互作用被破坏，结合水从蛋白质中释放出来，从而导致面筋网络结构的劣化。酵母细胞的活性或产气力是影响冷冻面制品品质的另一个关键因素，酵母活性较低在冷冻面团的后续发酵过程中，既不能产生足够的气体，也没有保持面筋蛋白的持气能力，这将导致烘焙产品的扁平形状、体积小和质地紧实。因此工业化生产中非常重视持水性和酵母细胞的活性，这些指标的优化有助于提高面团得率、节约成本[79]。近年来，γ-PGA对冷冻面制品的研究屡见报道，其中，王家宝[80]、宋佳薇[81]、谢新华[55]等将γ-PGA成功应用到全麦冷冻面团、面条、小麦淀粉凝胶中，如图8所示，添加1%（质量分数，下同）γ-PGA后，恒温冻藏组和冻融循环组的比容均明显增大，可能是因为γ-PGA提高了酵母存活率，增大了产气量，使得面团醒发高度上升，比容增大。此外，γ-PGA还能使冻藏期间面筋蛋白中弱结合水向自由水的转化量减少，限制了水分的流动，同时抑制了蛋白质二级结构中α-螺旋含量下降和无规卷曲含量增加，提高了热力学的稳定性。

图8 γ-PGA对面包比容的影响[80]Fig.8 Effect of γ-PGA on the specific volume of bread[80]

3.2 在细胞冻存中的应用

细胞在冷冻过程中的结构、存活率、以及代谢活力对工业应用和学术探究带来了严峻的挑战，保存细胞的技术大多采用低温保存和冷冻干燥技术[83]，传统的细胞冷冻液通常采用有机溶剂二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和培养基按照一定的比例混合，但是DMSO具有一定的毒性[84]，FBS有较高的病毒、霉菌和支原体等污染的风险，这种不利因素对细胞的损伤是不可逆转的。在目前的研究中学者们试图挖掘其他可替代的物质，尽可能地避免对DMSO和血清的使用，如甘油[85]、糖类（葡聚糖[83]、海藻糖[86]、海藻酸钠[87]）、蛋白类等[88-89]。对于γ-PGA在细胞冷冻保护方面的研究还需进一步深入的探索。

Jia Chunli等[76]发现γ-PGA显著提高了酵母细胞的存活率，增强了冷冻耐受性。另外，陈焕芸等[89]研究了γ-PGA对于细胞冻存的影响，发现添加γ-PGA的细胞在冻存1 周后，仍可保持良好的细胞形态与完整的细胞骨架。根据已有的研究推测γ-PGA保护细胞主要集中在两方面：1）分子侧链上存在可电离的-NH2和-COOH等官能团，能被细胞表面的配体识别，有利于细胞的黏附[90]。在冻存细胞表面，γ-PGA会形成类似薄膜的结构来保护细胞，提高细胞的复苏率，这种独特的保护方式更有利于细胞规模化的制备。2）游离的γ-PGA可以作为细胞外营养储存，增强了生物膜形成，保护细胞免受高浓度盐的吞噬攻击，维持细胞膜的完整性。

冷冻干燥技术是益生菌保藏时最常用的方法，但过低的温度（-40～-20 ℃）往往对益生菌的结构和活力造成损伤[91]。Bhat等[92]将γ-PGA应用在冷冻干燥过程中维持益生菌的活力，如图9所示，γ-PGA在短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）、长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）冷冻干燥过程（-40 ℃、500 Pa、48 h）中表现出与蔗糖相当的低温保护活性，并且质量分数10%的γ-PGA对副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）的保护作用明显优于相同添加量的蔗糖。

图9 γ-PGA和蔗糖对冷冻干燥过程中益生菌活力的影响[92]Fig.9 Effect of γ-PGA and sucrose on probiotic activity during freeze drying[92]

3.3 在冷冻肉制品中的应用

肉糜制品蛋白质含量丰富、口感鲜嫩不油腻，深受消费者喜爱，是食品加工业一个重要的发展方向。肉糜凝胶的形成过程实质上是蛋白质变性展开和聚集成大分子凝胶体的过程[93-94]。然而，反复的冻融循环会破坏体系的稳定，直接影响了肉糜制品的组织特性、凝胶强度和持水性。

赵岩岩等[82]应用质构仪和流变仪分析了γ-PGA对鱼糜凝胶制品的影响，结果表明，与对照组相比，凝胶的硬度、弹性、内聚性和咀嚼性均显著增加；添加不同比例γ-PGA处理组的G＇均呈现上升趋势，G＇可以作为反映肉糜凝胶强度的一个重要指标，G＇越高表明凝胶强度越好。此外，白登荣等[59]通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了γ-PGA在不同体系条件下对肌原纤维蛋白功能特性的影响，与未添加γ-PGA的蛋白样品相比，加入γ-PGA后的蛋白样品其肌球蛋白重链条带和肌动蛋白条带都明显减弱，表明γ-PGA与肌原纤维蛋白完成了交联，使体系中的负电荷增加，静电斥力也随之增加，蛋白质分子间隙增大，提高了凝胶强度和保水性。

4 结 语

γ-PGA作为一种新型绿色可食用的抗冻剂，具有保水、增稠、交联、抗氧化等良好性能，能够有效抑制水分迁移，起到冰晶修饰和稳定体系的作用，因此在食品工业领域具有很大的发展潜力。目前，学者们已证实了其优异的抗冻性和食品安全性，但是关于γ-PGA抗冻机理以及与其不同分子质量之间的深层机制尚不明确，这些领域仍需要人们深入的研究。可以预见，γ-PGA抗冻潜力的挖掘对推动新产品研发、相关产业和科学技术的进步具有重大意义。