一测多评法同时测定艾叶配方颗粒中6个酚酸类成分

王瑜婷，邝敏，何荣荣，潘玲，黎桃敏，钟志奎，孙冬梅（广东一方制药有限公司/广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244）

艾叶为菊科植物艾Artemisia argyiLevl. et Vant.的干燥叶，性温，味辛、苦，具有温经止血、散寒止痛的功效，内服治疗吐血、衄血、崩漏、月经过多、胎濡下血、少腹冷痛、经寒不调、宫冷不孕等疾病，外用可治疗皮肤痛痒[1-3]。现代研究表明，艾叶的主要化学成分为挥发油、酚酸类、黄酮类、萜类等，具有抗菌、抗病毒、平喘镇咳祛痰、止血、抗凝血、抗过敏、镇静、护肝利胆及补体激活等作用[4]。

酚酸类成分具有清除自由基、抗菌、消炎、抗病毒、保肝利胆、降血压、降血脂等作用，是艾叶重要的药效物质。植物中广泛存在的绿原酸异构体有绿原酸（3-咖啡酰奎尼酸）、隐绿原酸（4-咖啡酰奎尼酸）、新绿原酸（5-咖啡酰奎尼酸）、异绿原酸A（3，5-二咖啡酰奎尼酸）、异绿原酸B（3，4-二咖啡酰奎尼酸）、异绿原酸C（4，5-二咖啡酰奎尼酸）等[5]。一测多评（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）法是选定一个成分作内参物，同时实现多个同类型化合物的含量测定方法，回避了多对照品、高配置检测仪器的检测条件，适合中药质量评价检测特点[6]。因此，本文以绿原酸作为内参物，建立艾叶配方颗粒的QAMS法，同时测定新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C的含量，不仅节约了检测成本，同时为进一步提高艾叶配方颗粒整体质量控制水平提供了科学依据。

1 仪器与试药

Waters H-Class型超高效液相色谱仪（Waters公司）；Agilent 1290型超高效液相色谱仪（Agilent公司）；Shimadzu LC-40型超高效液相色谱仪（岛津公司）；XP26型百万分之一天平、ME204E型万分之一天平（METTLER TOLEDO公司）；Milli-Q Direct型超纯水系统（Merck公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

绿原酸（批号：110753-202018，纯度：96.1%，中国食品药品检定研究院）；新绿原酸（批号：DSTDX001503，纯度：99.58%）、隐绿原酸（批号：DST220104-035，纯度：99.3%）、异绿原酸C（批号：DSTDY003802，纯度：99.58%）（德思特生物技术有限公司）；异绿原酸B（批号：wkq210222206，纯度：99.85%）、异绿原酸A（批号：wkq21020306，纯度：99.45%）（四川省维克奇生物科技有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，Merck股份有限公司），甲酸（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。13批艾叶配方颗粒（编号：S1～S13，广东一方制药有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脱（0～2 min，8%A；2～4 min，8%～10%A；4～8 min，10%～15%A；8～12 min，15%～18%A；12～18 min，18%～19%A；18～22 min，19%～21%A；22～25 min，21%～37%A；25～28 min，37%～100%A；28～32 min，100%A；32～35 min，100%～8%A；35～45 min，8%A）；流速：0.3 mL·min-1；柱温：30℃；检测波长：325 nm；进样量：1 μL。

2.2 对照品溶液的制备

分别取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为55.140、68.189、56.138、121.078、71.121、135.035 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取艾叶配方颗粒适量，研细，取约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，称定重量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）30 min，取出，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验 分别精密吸取空白溶剂、混合对照品溶液及供试品溶液（S12）进样测定，结果见图1。可见，供试品溶液色谱在与对照品溶液色谱相应的保留时间处具有相同的色谱峰，且空白溶剂无干扰，表明该方法专属性良好。

图1 专属性试验UPLC色谱图Fig 1 UPLC diagram of specific test

2.4.2 线性关系考察 分别精密吸取“2.2”项下混合对照品储备液0.5、1.0、3.0、5.0、8.0、10 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成系列质量浓度的混合对照溶液。按“2.1”项下色谱条件进样测定，以对照品溶液质量浓度（μg·mL-1）为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，结果见表1。可知6个成分在相应质量浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。

表1 6个成分的线性关系考察结果Tab 1 Linearity of 6 components

2.4.3 精密度考察 精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液，连续进样6次，计算得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C峰面积的RSD均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 取艾叶配方颗粒（S12），精密称定，按“2.3”项下方法制备，分别在0、4、8、12、24、48 h进样测定，计算得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C峰面积的RSD均小于2.0%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.4.5 重复性试验 取艾叶配方颗粒（S12），精密称定，平行称定6份，按“2.3”项下方法制备，进样测定。计算得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C含量的RSD均小于2.0%，表明该方法重复性良好。

2.4.6 加样回收试验 取已知含量的艾叶配方颗粒（S12），精密称取9份，每份约0.1 g，置具塞锥形瓶中，均分为3组，每组分别精密加入相当于含有量50%、100%、150%的混合对照品溶液，按“2.3”项下方法制备，进样测定，计算加样回收率及RSD，结果见表2。新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C的平均加样回收率在90.6%～102.0%，RSD均小于5.0%，表明该方法准确性良好。

表2 6个成分的加样回收试验结果(n＝3)Tab 2 Recovery of the 6 components (n＝3)

2.5 QAMS法的建立

2.5.1 相对校正因子（ƒ）的确定 取“2.2”项下混合对照品溶液，以绿原酸作为内参物，考察不同进样量（0.2、0.5、0.8、1.0、1.5 μL）下新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C的ƒ。公式为ƒs/i＝ƒi/ƒs＝（Ci/Ai）/（Cs/As）＝（Ci×As）/（Cs×Ai），式中As为内参物峰面积，Cs为内参物浓度，Ai为某待测成分峰面积，Ci为待测成分浓度[7]。计算得ƒ分别为1.00、0.94、1.20、1.25、1.16，RSD分别为0.00%、0.48%、0.95%、1.0%、1.7%，结果见表3。

表3 5个成分的相对校正因子(n＝5)Tab 3 Relative correction factors of 5 components (n＝5)

2.5.2 色谱仪及色谱柱对ƒ的影响 以绿原酸为内标物，考察其他成分在不同超高效液相色谱仪Waters H-Class型、Agilent 1290型、Shimadzu LC-40型，以及不同色谱柱ZORBAX RRHD SB C18（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）、ACQUITY UPLC HSS T3（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）、CORTECS UPLC T3（150 mm×2.1 mm，1.6 µm）下的ƒ，结果见表4，各成分的ƒ的RSD均小于2.0%，表明不同色谱系统和色谱柱对各成分的ƒ无显著影响。

表4 不同色谱仪和色谱柱对相对校正因子的影响(n＝3)Tab 4 Effect of instrument and column on relative correction factor (n＝3)

2.5.3 流速对ƒ的影响 以绿原酸为内标物，考察不同流速（0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mL·min-1）下的ƒ，结果见表5，各成分的ƒ的RSD均小于1.0%，表明不同流速对各成分的ƒ无显著影响。

表5 不同流速对相对校正因子的影响(n＝3)Tab 5 Effect of flow velocity on relative correction factor (n＝3)

2.5.4 柱温对ƒ的影响 以绿原酸为内标物，考察不同柱温（25、28、30、35℃）下的ƒ，结果见表6，各成分的ƒ的RSD均小于1.0%，表明不同柱温对各成分的ƒ无显著影响。

表6 不同柱温对相对校正因子的影响(n＝3)Tab 6 Effect of column temperature on relative correction factor (n＝3)

2.5.5 检测波长对ƒ的影响 以绿原酸为内标物，考察不同检测波长（320、323、325、327、330 nm）下的ƒ，结果见表7，各成分的ƒ的RSD均小于2.0%，表明不同检测波长对各成分的ƒ无显著影响。

表7 不同检测波长对相对校正因子的影响(n＝3)Tab 7 Effect of detectionwavelength on relative correction factor (n＝3)

2.5.6 梯度程序对ƒ的影响 以绿原酸为内标物，考察“2.1”项下梯度程序波动（-5%～+5%）下的ƒ，结果见表8，各成分的ƒ的RSD均小于5.0%，表明不同梯度程序对ƒ无显著影响。

表8 不同梯度程序对相对校正因子的影响(n＝3)Tab 8 Effect of gradient program on relative correction factor (n＝3)

2.6 待测成分色谱峰的定位

目前，常用的色谱峰定位方法有相对保留值法、保留时间差法、时间校正法、对照提取物法等。保留时间差法计算公式为Δti/s＝ti-ts；相对保留值法计算公式为ti/＝ti/ts

[8]。本文采用相对保留值法，以绿原酸为内参物，考察其他成分在不同超高效液相色谱仪以及色谱柱下的相对保留值，结果见表9，各成分相对保留值的RSD均小于2.0%，表明不同色谱系统和色谱柱对各成分相对保留值无显著影响。

表9 不同色谱仪和色谱柱对相对保留值的影响(n＝3)Tab 9 Effect of instrument and column on relative retention time (n＝3)

2.7 外标法（ESM）和QAMS法结果对比

取13批艾叶配方颗粒适量（S1～S13），精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，分别采用ESM和QAMS法测定各成分含量，利用SPSS 26.0软件对结果进行Pearson相关系数（r）分析，结果见表10，两种方法的r均为1.000，具有高相关性（P＞0.05）。验证ESM和QAMS法测定艾叶配方颗粒中新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C的含量，计算2种测定方法下的相对误差，相对误差（%）＝（QAMS含量-ESM含量）/QAMS含量×100%[9]，结果显示新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C的测定相对误差范围分别为0.85%～1.10%、0.00%～0.24%、0.44%～0.59%、0.14%～0.39%、0.65%～0.79%，均小于1.2%，表明建立的艾叶配方颗粒QAMS法测定结果准确可靠。

表10 6个成分的含量测定结果(n＝3，%)Tab 10 Content determination of 6 components (n＝3，%)

3 讨论

3.1 待测组分的选择

艾叶配方颗粒为艾叶饮片经水提、分离、浓缩、干燥、制粒而成的颗粒，在中医药理论指导下，按照中医临床处方调配后，冲服使用。目前有关艾叶药材或饮片的多指标含量测定报道较多[10-13]，对相关制剂定量分析的报道较少。艾叶中含量较高的药效成分有酚酸类、挥发油等，其中酚酸类成分为水溶性成分，易于检测，因此本研究将6个酚酸类成分作为艾叶配方颗粒质量控制的指标[14-15]，其中，绿原酸含量、保留时间适中，易于对其他成分进行定位，且绿原酸对照品来源充足，化学性质较稳定，选其作为内参物能够充分体现QAMS法低成本的优势。

3.2 提取方法及色谱条件的选择

本研究对供试品溶液的提取方式（超声法、回流法），提取溶剂（50%乙醇、80%乙醇、无水乙醇、50%甲醇、80%甲醇、甲醇），提取时间（30、45、60 min）和稀释倍数（25、50、100 倍）进行考察。结果表明，按“2.3”项下方法制备供试品溶液时色谱峰分离度较好。采用PDA检测器在210～400 nm内对供试品溶液进行扫描，发现在325 nm时色谱图基线平稳、噪声小，各组分的响应值较高，因此，选择325 nm作为检测波长。

3.3 QAMS法的建立

正确定位各待测成分的色谱峰是评价QAMS法可行性的重要步骤，本研究应用不同高效液相色谱仪和品牌色谱柱，分别考察保留时间差和相对保留时间的可靠性，最终发现相对保留时间更能准确定位各待测成分色谱峰。常用来计算ƒ的方法有多点校正法和斜率校正法，而采用斜率校正法，要求标准曲线线性关系较好，斜率与截距之比大于100，计算得到的校正因子才具有较好的重复性和准确性[16]，故本研究采用多点校正法计算ƒ，方法学耐用性考察中RSD均小于5.0%，表明该方法稳定可行，可为艾叶配方颗粒的质量控制提供参考。