肟菌酯在斑马鱼中的生物富集效应研究

王卢燕, 张昌朋, 王祥云, 何红梅,赵学平, 蒋金花

(省部共建农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室，农业农村部农药残留检测重点实验室，浙江省农业科学院 农产品质量安全与营养研究所，杭州 310021)

肟菌酯 (trifloxystrobin) 属于甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，该类杀菌剂通过阻止细胞色素bc1 Qo 位点的电子传递，抑制线粒体的呼吸作用而起到抑菌效果[1]。肟菌酯具有高效、广谱等特性，对子囊菌、担子菌、半知菌和卵菌等多个纲的真菌有效，主要用于水稻、小麦、玉米、棉花、花生、油菜、甜菜等多种作物上，可有效防治白粉病、霜霉病、锈病及稻瘟病等多种病害[1]。

肟菌酯在田间施用后可以通过渗透、径流、迁移等多种途径进入水环境，并通过水体进入水生生物体内，进而影响水生生物的生长、发育和繁殖[2-4]。肟菌酯对不同水生生物具有高毒或剧毒，对热带爪蟾、稀有鮈鲫、草鱼、斑马鱼、虹鳟鱼、大型溞等的LC50值为0.001～0.530 mg/L[5-10]。研究发现，甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂对鱼类具有一定的生物富集效应，斑马鱼在0.005 和0.05 mg/L的啶氧菌酯溶液中暴露8 d 后，啶氧菌酯在鱼体内的浓度可达到0.48～5.27 mg/kg，生物富集系数(BCF) 为80.00～99.42，在斑马鱼中具有中等富集效应[11]。肟菌酯在虹鳟鱼中的生物富集系数为431[12]，并且低浓度暴露在鱼体内也具有较强的累积效应，稀有鮈鲫胚胎在1.0 μg/L 的肟菌酯溶液中暴露144 h 后，仔鱼体内肟菌酯的平均含量可达到89.56 pg[6]。另有研究发现，肟菌酯在美国13 个州的29 条河流中的最高检出质量浓度为0.029 μg/L，在不同国家作物施药后附近水体中的检出浓度为0.41～0.73 μg/L[13-15]。因此，建立鱼体中低浓度肟菌酯残留的检测方法，并研究其生物富集效应，对阐明肟菌酯残留对水生生物的生态毒理学风险具有重要意义。

水生生物基准 (aquatic life benchmarks，ALB)是指水环境中的污染物对水生生物及其使用不产生短期和长期不良或有害效应的最大允许浓度，是建立污染物水环境质量管理、评价、预测和污染控制体系的科学依据[16]。美国环境保护署 (EPA)在农药风险评估过程中，会基于农药对水生生物的急性毒性或慢性毒性等数据，确定农药对水生生物的ALB，进而制定农药的环境水质标准并进行相应的生态风险评估[16]。目前美国EPA 在评估农药对鱼类的生态风险时，主要基于虹鳟鱼、鲦鱼、蓝鳃鱼的LC50值确定其急性ALB。EPA 发布的肟菌酯对鱼类的急性ALB 值为0.007 15 mg/L[16]，而我国在评价农药对鱼类的环境风险时，大多采用斑马鱼的急性毒性数值 (LC50值) 进行评估[17]。现有研究发现，肟菌酯对虹鳟鱼、蓝鳃鱼和鲦鱼的LC50值分别为0.015、0.054 和0.078 mg/L[12]，对斑马鱼成鱼的96 h-LC50值为51.05～120 μg/L[18-19]，可见肟菌酯对鱼类的毒性较高，并且对不同种类鱼类的毒性之间具有一定差异。因此，进一步研究不同浓度肟菌酯在斑马鱼中的生物富集性差异，对于全面评价肟菌酯对鱼类的生态毒理学风险，以及建立符合我国水生生态风险评估的方法体系具有一定的指导意义。

PRiME HLB 是一种通过吸附和去除样品中干扰物以减少基质干扰效应的前处理净化方法，在动物源样本的药物残留检测中已得到很好的应用[20-21]。本研究采用PRiME HLB 固相萃取结合超高效液相色谱-串联质谱仪 (UPLC-MS/MS) ，建立了一种水体和鱼肉中低浓度肟菌酯残留的快速、简便检测方法，并在此基础上，开展了基于ALB 和LC50值的低浓度肟菌酯在斑马鱼体内的生物富集效应研究，以期为水环境中肟菌酯污染的风险评价提供科学的技术方法和依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

ABSciex 超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪 (Exion LCAD-Triple QuadTM5500，美国ABSciex 公司)；ACQUITY UPLCTMBEH C18色谱柱 (2.1 mm × 100 mm × 1.7 μm，美国Waters 公司)；SPS 402F 型电子天平 [0.01 g，梅特勒-托利多 (常州) 测量技术有限公司]；BSA224S 电子天平 (0.0001 g，德国赛多利斯集团)；TD5A-WS 型台式大容量低速离心机 (金南仪器制造有限公司)；Eppendorf Centrifuge 5430R 高速冷冻离心机(德国艾本德股份公司) 等。

97%肟菌酯 (trifloxystrobin) 原药 (江苏耘农化工有限公司)；99.3% 肟菌酯标准品 (德国Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司)；乙腈、甲酸为色谱纯，无水硫酸钠、无水硫酸镁、氯化钠为分析纯；屈臣氏纯净水 (广州屈臣氏食品饮料有限公司)；2 mL Cleanert MAS-Q 净化管 (PSA 50 mg + C1850 mg +PC 50 mg + MgSO4150 mg) 及Cleanert S C18-SPE 小柱 (500 mg/6 mL) (天津博纳艾杰尔科技有限公司)；Oasis PRiME HLB 小柱 (60 mg/3 mL，美国Waters 公司)。

1.2 试验材料

斑马鱼Danio rerio种鱼，购自中国科学院水生生物研究所国家斑马鱼资源中心，AB 型品系。本研究采用6 月龄成鱼，为种鱼繁殖所得。试验用水为曝气除氯24 h 以上并经活性炭过滤的自来水。

1.3 标准溶液配制

准确称取肟菌酯标准品0.0121 g，用乙腈定容至10.0 mL，配成1.20 × 103mg/L 的标准储备液；用乙腈进一步稀释标准储备液，得到质量浓度为10.0 mg/L 的标准工作溶液；采用空白基质溶液逐级稀释标准工作溶液，制得质量浓度为0.0001、0.0005、0.001、0.005、0.01 及0.05 mg/L 的系列基质匹配标准工作溶液。

1.4 仪器条件

色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLCTM BEH C18柱 (2.1 mm × 100 mm × 1.7 μm)，柱温40 °C；进样量1 μL；流动相A 为0.1% 甲酸水溶液，B 为色谱纯乙腈，VA:VB= 20 : 80，流速0.3 mL/min；进样时间为4.0 min。

质谱条件：ESI+离子源；多反应监测 (MRM)模式；毛细管电压5.5 kV；气帘气压力241.5 kPa；喷撞气压力48.3 kPa；喷雾气压力345 kPa；辅助加热气压力345 kPa；离子源温度550 °C；输入电压10 V；碰撞室输出电压16 V；其余质谱检测参数见表1。在此条件下，肟菌酯保留时间为2.46 min。

1.5 样品前处理

水样前处理：取5.0 mL 样品，加入2.00 g 氯化钠和10.0 mL 乙腈，涡旋1 min，静置分层。取上层清液过0.22 μm 滤膜，待UPLC-MS/MS 测定。

鱼肉样品前处理：称取1.00 g (精确至0.01 g)鱼肉样品置于50 mL 离心管中，加入1.0 mL 0.1%的甲酸水溶液和10.0 mL 乙腈，涡旋15 min；加入1.00 g 无水硫酸钠和1.00 g 无水硫酸镁，涡旋15 min；在4000 r/min 下离心5 min。准确移取离心管中的上清液2.0 mL 直接过PRiME HLB 固相萃取柱，经0.22 μm 滤膜过滤，待UPLC-MS/MS测定。

1.6 生物富集试验

为进一步明确利用EPA 鱼类ALB 和斑马鱼急性毒性相关数值评估肟菌酯对鱼类生态风险的差异，开展了基于ALB 和斑马鱼的LC50值浓度肟菌酯在斑马鱼体内的生物富集效应研究。参照《化学农药环境安全评价试验准则 第七部分：生物富集试验》[22]，采用半静态法，分别测定了肟菌酯在鱼类急性毒性ALB (7.15 × 10-3mg/L)、1/10 ALB 以及对斑马鱼的1/10 LC50值和1/100 LC50值暴露下在斑马鱼成鱼中的生物富集效应。因肟菌酯对斑马鱼成鱼的96 h-LC50值为51.05～120 μg/L[18-19]，故其LC50值选取51.0 和120 μg/L两个浓度同时进行研究。因此，共设置7.15 ×10-4和7.15 × 10-3mg/L、5.10 × 10-4和5.10 × 10-3mg/L、1.20 × 10-3和1.20 × 10-2mg/L 6 个质量浓度处理组，同时设置曝气自来水为空白对照。根据设定的浓度，分别配制5 L 试验药液，每缸放入15 条斑马鱼，每处理设3 次重复。试验过程每24 h 更换全部试验药液，于暴露后0、24、48、96、144 及192 h 分别从各处理中取水样与鱼样，测定水样与鱼样中的肟菌酯含量。

按(1)式计算肟菌酯的生物富集系数 (BCF) 。

式中：Cfs为鱼体内的肟菌酯含量 (mg/kg)；Cws为水体中的肟菌酯含量 (mg/L)。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的优化

分别采用甲醇、乙酸乙酯和乙腈3 种有机溶剂作为提取溶剂，在添加水平为1.0 mg/kg 下，按照1.5 节中鱼肉样品前处理方法，比较了鱼肉中肟菌酯的提取回收率。其中，提取溶剂为甲醇时，加入无水硫酸钠和无水硫酸镁可以除去水分；提取溶剂为乙酸乙酯和乙腈时，加入无水硫酸钠和无水硫酸镁以使之分层。结果表明：采用甲醇、乙酸乙酯和乙腈提取时的回收率分别为78.5%、88.9%和83.9%，其中乙酸乙酯的提取回收率最高，但是其提取液中杂质较多，甲醇的提取回收率较低。综合考虑溶剂挥发性、提取回收率、杂质去除效果等因素，最终选择乙腈作为提取溶剂。

2.2 净化方法的选择

采用Cleanert MAS-Q 净化管、C18固相萃取柱及HLB 固相萃取柱分别进行试验。鱼肉中肟菌酯添加水平为1.0 mg/kg，每组设3 个重复。结果表明：PSA 50 mg + C1850 mg + PC 50 mg + MgSO4150 mg 的Cleanert MAS-Q 净化管净化后回收率为48.3%，C18固相萃取柱净化后回收率为42.7%，HLB 小柱净化后回收率为84.5%；此外，比较HLB 柱活化 (82.9%) 与未活化 (81.4%) 后肟菌酯的回收率发现，活化与否对结果没有显著影响。综合考虑回收率、杂质去除效果和操作过程简便性等因素，最终选择Oasis PRiME HLB 固相萃取柱作为鱼肉中肟菌酯的净化小柱。

2.3 标准曲线

将0.0001、0.0005、0.001、0.005、0.01 和0.05 mg/L 的基质匹配标准工作溶液按照1.4 节仪器条件进样测定，以浓度-峰面积绘制肟菌酯基质匹配标准曲线，其回归方程为y= 96 612 211x+24 728 (R2= 0.9998)，表明肟菌酯在0.0001～0.05 mg/L 范围内具有良好的线性关系。

2.4 正确度和精密度

在空白水样中添加0.0005 和0.05 mg/L 2 个水平的肟菌酯标准工作溶液，在空白鱼肉样品中添加0.01、0.1 和10 mg/kg 3 个水平的肟菌酯标准工作溶液，每添加水平设5 个重复。平均回收率和相对标准偏差 (RSD) 结果见表2。肟菌酯在水样和鱼肉样品中的定量限 (LOQ) 分别为0.0005 mg/L和0.01 mg/kg。所建立方法的正确度和精密度均较好，能够满足本研究水样及鱼样中肟菌酯残留测定要求。

表2 水样和鱼肉样品中肟菌酯的添加回收率和相对标准偏差Table 2 The recovery and RSD of trifloxystrobin in water and fish samples

2.5 肟菌酯在斑马鱼体内的富集效应

从暴露处理开始，肟菌酯在斑马鱼体内有一个快速累积的过程 (表3)。在较低质量浓度水平(5.10 × 10-4、7.15 × 10-4和1.20 × 10-3mg/L) 下暴露24 h，鱼体内肟菌酯含量分别为0.0487、0.0784 和0.130 mg/kg；192 h 后，鱼体内肟菌酯含量分别增长到0.0609、0.100 和0.153 mg/kg，BCF 值增长到136、141 和147。在较高质量浓度水平 (5.10 × 10-3、7.15 × 10-3和1.20 × 10-2mg/L)下暴露24 h 后，鱼体内肟菌酯含量分别为0.555、0.856 和1.33 mg/kg；192 h 后，鱼体内肟菌酯含量分别增长到0.720、1.01 和1.72 mg/kg，BCF 值分别达到156、171 和178。可见，高浓度肟菌酯暴露可在斑马鱼中产生较高的残留累积，但不同浓度肟菌酯在斑马鱼中的富集效应差异不大。研究表明，肟菌酯在斑马鱼体内存在中等富集效应。

表3 肟菌酯在斑马鱼体内的生物富集性Table 3 The bioconcentration of trifloxystrobin in zebrafish

3 结论与讨论

现有研究报道中，甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂啶氧菌酯在鱼肉中的残留检测采用乙腈提取后直接过滤膜的样品前处理方法，肟菌酯在稀有鮈鲫胚胎中的残留检测采用90%乙腈提取、液-液萃取后经硅胶萃取柱净化的前处理方法，嘧菌酯在水产品中的残留检测采用1%乙酸 + 乙腈提取、聚苯乙烯-二乙烯基苯 (PS-DVB) 和PSA 净化的前处理方法[6,11,23]。由于鱼肉基质复杂，含有大量的蛋白质、脂肪等干扰物，不净化直接测定会产生一定的基质效应且对仪器损害大，因此，本研究通过对提取溶剂和净化方法的优化，建立了水样和鱼肉样品中肟菌酯的HLB固相萃取-UPLCMS/MS 检测方法。Oasis PRiME HLB 共聚物具有极强的水浸润性，可省去活化和平衡步骤[24]。相比传统的固相萃取法，本方法不需要活化平衡萃取柱，节省了过柱时间和溶剂使用量，能很好地吸附鱼肉中大部分脂肪、蛋白质等干扰物而不影响回收率，水样和鱼肉样品中的定量限 (LOQ) 分别可达到0.0005 mg/L 和0.01 mg/kg。所建立的方法能够检测水体和鱼肉中低浓度的肟菌酯残留，可为开展环境中肟菌酯的残留行为和风险评估研究提供参考。

随着肟菌酯等甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的广泛使用，其在环境中的残留以及生态毒理学风险已受到越来越多的关注。生物富集作用是评价环境中残留农药对生物体及生态系统危害的重要指标[22]。鱼类作为水环境中的重要生物和人类的主要食物，其生态毒理反应和变化可作为水环境评价的重要指标。美国EPA 发布的鱼类毒性基准中，主要是基于虹鳟鱼、鲦鱼、蓝鳃鱼3 种水生生物最低LC50值的1/2 确定其急性ALB[16]。现有研究表明，肟菌酯对于不同鱼类以及不同水生生物具有一定的毒性差异[16]，而目前进行农药对鱼类的风险评估时，不仅要参考EPA 等国外评估报告中有关虹鳟鱼、鲦鱼等鱼类的毒性数据，同时也要评估农药对斑马鱼的毒性风险，因此，比较不同鱼类ALB 值在斑马鱼中的生物富集性差异，可为探索符合我国水生生物的生态风险评估体系提供一定的参考依据。

本研究发现，将斑马鱼暴露于鱼类ALB 和斑马鱼LC50值相关系列质量浓度7.15 × 10-4和7.15 ×10-3mg/L、5.10 × 10-4和5.10 × 10-3mg/L、1.20 ×10-3和1.20 × 10-2mg/L 药液中24 h 后，肟菌酯在斑马鱼体内的残留量分别为0.0784、0.856、0.0487、0.555、0.130 和1.33 mg/kg。研究表明，不同浓度的肟菌酯均可在斑马鱼体内快速累积，并且在暴露48 h 后基本达到稳定。连续暴露192 h后，鱼类ALB 值相关浓度7.15 × 10-4和7.15 ×10-3mg/L 肟菌酯在斑马鱼中的生物富集系数为117～171，1/100 LC50值浓度 (5.10 × 10-4和1.20 ×10-3mg/L) 肟菌酯的生物富集系数为113～147，1/10 LC50值浓度 (5.10 × 10-3和1.20 × 10-2mg/L)肟菌酯的生物富集系数为128～178，具有中等富集效应。欧盟食品安全局 (EFSA)的研究表明，肟菌酯在虹鳟鱼中的生物富集系数为431[12]，本研究结果与之具有一定差异。综上可见，肟菌酯对不同种类鱼类的急性毒性和生物富集效应都存在一定的差异，因此，在研究肟菌酯残留污染对鱼类的生态风险时，应结合不同浓度和不同鱼类的毒性效应及生态毒理学风险进行综合评估。

斑马鱼生物富集试验对评价肟菌酯的环境行为及其慢性危害具有十分重要的意义。一般情况下，农药的生物富集作用越强，对生物的慢性危害越大。现有研究表明，在急性ALB 和对斑马鱼的LC50值相关浓度暴露下，肟菌酯在斑马鱼中具有中等富集效应，因此，在实际使用过程中，应关注低浓度肟菌酯对鱼类的潜在危害及食物链的放大风险，加强对水生生态系统的残留监测和风险评估。在美国EPA 发布的鱼类毒性基准中，慢性ALB 主要基于慢性毒性浓度[无观察效应浓度(NOEC) 及最低观察效应浓度 (LOEC)]等数据[16]。而我国在评价农药对鱼类的环境风险时，大多数都采用斑马鱼的急性毒性数据进行评估[17]，对部分原药同时会进行鱼类早期生活阶段毒性试验[25]。美国EPA 发布的肟菌酯慢性ALB 值为0.0043 mg/L，主要是基于肟菌酯对虹鳟鱼游动影响的NOEC[12,16]。而目前关于肟菌酯在斑马鱼中的研究主要集中在胚胎阶段的急性毒性效应，肟菌酯对斑马鱼早期发育阶段以及成鱼的慢性毒性仍鲜有研究报道[18]。因此，为了更全面、系统地评价肟菌酯对环境的安全性，还需进一步研究其对斑马鱼早期生活阶段和成鱼的慢性毒性效应，以及开展对其他非靶标生物的慢性毒性试验等。