气相色谱-三重四极杆串联质谱法测定4 种果品中99 种农药残留

张海燕, 李艳美, 华 鹏

(1.乌鲁木齐海关技术中心 (库尔勒)，新疆 库尔勒 841000；2.中华人民共和国库尔勒海关，新疆 库尔勒 841000；3.伊宁海关技术中心，新疆 伊宁 835000)

我国新疆巴州地区以其独特的地理气候环境培育了一大批品质优良的水果，如若羌红枣、轮台白杏、库尔勒香梨等已成为国家地理标志性产品。农药在促进作物丰产、减少病虫害的同时，其不合理使用导致的污染已影响到农产品质量安全。我国虽然规定了上述水果中多种农药的最大残留限量 (MRL)[1]，但仍有部分农药残留尚无MRL 值，且在已规定 MRL 值的农药中用于干枣的数量较少，针对其进行多种农药残留量的分析确证方法也不多，如我国标准 GB 2763—2021《食品中农药最大残留限量》规定了干枣中 46项、杏中 148 项、梨中 125 项以及葡萄中 216 项的MRL 值从 0.01～5 mg/kg 不等[1]。欧盟标准规定了上述果品中多数农药残留限量为 0.01 mg/kg[2]。

目前关于农药残留样品前处理方法主要有QuEChERS 法[3-4]、固相微萃取法 (SPME)[5]、凝胶渗透色谱法 (GPC)[6]、液液萃取法 (LLE)[7]、固相萃取法 (SPE)[8]、加速溶剂萃取法 (ASE)[9]等，其中 QuEChERS 方法使用较为广泛。检测方法主要有气相色谱 (GC) 法[10]、气相色谱-质谱 (GC-MS)法[11]、气相色谱-串联质谱 (GC-MS/MS) 法[12]、液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 法[13]、飞行时间-质谱 (TOF-MS) 法[14-15]、轨道阱质谱 (Obitrap-MS)法[16]、高效液相色谱 (HPLC) 法[17]等。其中 ，TOF-MS 法和 Obitrap-MS 法因设备价格昂贵而未普及，而GC 法和 HPLC 法因只能测定特定类型的化合物而限制了其广范使用。相比 GC-MS 法，GC-MS/MS 由于使用二级质谱定性，具有更强的检测灵敏度和选择性，抗干扰能力更强。

本研究结合我国农药残留限量国家标准，建立了红枣(干)、杏、葡萄和香梨 4 种果品中 99 种农药残留量测定的GC-MS/MS 方法，涉及12 种氨基甲酸酯类、34 种有机磷类、16 种有机氯类、10 种拟除虫菊酯类和7 种三唑类及其他化合物。其中，包含 GB 2763—2021 中既未指定检测方法、又无残留限量标准(或只有临时限量标准) 的6 种农药 (速灭威、杀线威、甲硫威、残杀威、特丁硫磷和氟菌唑)，指定 HPLC 或LC-MS/MS 检测方法的 6 种农药 (霜霉威、灭多威、敌百虫、烯效唑、啶虫脒和烯酰吗啉)，以及 GB 23200.113—2018《食品安全国家标准 植物源性食品中 208 种农药及其代谢物残留量的测定 气相色谱-质谱联用法》[18]中未包含的除上述农药外的其他 12 种农药(甲萘威、氟乐灵、3-羟基克百威、氟虫腈、稻丰散、苯线磷、虫螨腈、炔螨特、螺螨酯、吡唑醚菌酯、噻嗪酮及百菌清)。对市场采购的 89 份样品中的农药残留量进行了分析。相比传统方法，本研究快速简便，避免了乙腈对色谱系统的伤害，使用成本低。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

气相色谱-串联质谱仪 (GC trace 1310 TSQ 8000 EVO 型，配 Tracefinder 3.3 软件，美国Thermo-Fisher 公司)；高速离心机 (CF16 RXII 型，日本HITACHI 公司)；电子天平 (SB 3200 型，瑞士METTLER TOLEDO 公司)；涡旋仪 (MS3 型，德国 IKA 公司)；水浴氮吹仪 (N-EVAP 112 型，美国 Organomation 公司)；超声波清洗器 (SB 5200型，中国上海必能信超声有限公司)；微孔滤膜(尼龙，0.22 μm，美国安捷伦公司)。

99 种农药标准品(1000 mg/L，北京曼哈格公司)见表1。正己烷、丙酮和乙腈(色谱纯，美国Fisher Scientific 公司)。净化剂：N-丙基乙二胺(PSA，粒径40～63 μm )、氨基净化剂 (NH2，粒径40～63 μm)、十八烷基键合硅胶 (C18，粒径 40～63 μm)、石墨化碳黑 (GCB，粒径 38 μm) 和Carb/NH2固相萃取柱(500 mg/6 mL)，均为北京振祥公司，氯化钠(分析纯，天津市光复科技发展有限公司)，试验用水 Milli-Q 超纯水。

续表1Table 1 (Continued)

选择新疆巴州地区4 种代表性水果基质红枣(干)、杏、葡萄和香梨，它们多数为弱酸性，分别代表干果类、核果类、浆果类和仁果类水果，样品均购自当地超市和农贸市场。

1.2 分析方法

1.2.1 仪器检测条件

色谱条件：TG-5 MS 石英毛细管色谱柱(30 m × 0.25 mm，0.25 μm)；升温程序：70 °C 保持 1 min，以20 °C/min 升至 210 °C，保持 1 min；以 10 °C/min 升至 280 °C，保持 3 min；以 20 °C/min升至 300 °C，保持 2 min；载气为氦气，流速 1.0 mL/min，恒流模式；进样口温度 260 °C；进样量1 μL；不分流进样。

质谱条件：电子轰击电离源 (EI )，电子能量70 eV；离子源温度 280 °C；传输线温度280 °C；溶剂延迟时间 4.0 min；多反应监测 (MRM ) 模式。碰撞气为氩气 (纯度≥ 99.999% )。

1.2.2 样品前处理 准确称取 5 g (精确至 ± 0.01 g)样品，加入10 mL 乙腈 (干红枣样品提前加入10 mL水)，涡旋混匀后超声 20 min；加入 5.0 g 氯化钠，于 11 000 r/min 下离心 5 min；取上清液 2 mL，加入预先装有 25 mg PSA (干红枣、香梨均为 50 mg)、10 mg C18(干红枣 25 mg )、0 mg GCB (干红枣5 mg) 净化剂的离心管，于 4000 r/min 下离心5 min；上清液于 40 °C 水浴氮吹近干，用 1 mL 丙酮复溶，过 0.22 μm 尼龙微孔滤膜，待 GC-MS/MS检测分析。

1.2.3 标准溶液配制 用丙酮稀释标准品溶液，配制成 100 mg/L 的单标储备液；再用丙酮稀释单标储备液，配制成各农药组分质量浓度均为 5 mg/L的混合标准中间溶液；根据测定需求，以丙酮逐级稀释成 2 μg/mL 混合标准工作溶液，-18 °C 保存。按 1.2.2 节方法提取不含目标化合物的空白样品，根据需要配制成 0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.2 和0.5 mg/L 系列质量浓度的基质匹配标准工作溶液，现配现用。按 1.2.1 节方法和表1 所列条件测定，以质量浓度 (x) 为横坐标、目标化合物定量离子的峰面积为纵坐标 (y)绘制标准曲线，得到 99 种农药的线性方程和相关系数。

1.2.4 基质效应 基质效应与目标化合物的化学性质、样品前处理方式、基质类型密切相关，含有羧基、氨基、酰胺基、羟基等官能团的化合物表现为更强的基质增强或抑制效应[19]。常采用 3种方法降低基质效应对化合物定量的影响：加入合适的分析保护剂； 采用适当的内标；使用基质匹配校准曲线定量。因分析保护剂并不能适用所有基质，为所有目标物找到各自的内标成本又较高，因此本试验采用基质匹配外标法。通过Me/% = [(km-ks)/ks] × 100 评价基质效应大小(km为目标物在空白基质中校准曲线的斜率，ks为目标物在溶剂中校准曲线的斜率)。当Me＜ 0，体现为基质抑制效应，Me＞ 0 体现为基质增强效应；∣Me∣＜ 20% 时为弱基质效应，当 20% ≤∣Me∣≤ 50% 时为中等基质效应，当∣Me∣ ＞ 50%时为强基质效应。

2 结果与讨论

2.1 仪器分析方法建立

2.1.1 色谱条件的优化 对比了两种升温程序时，2 μg/mL 混合标准工作溶液的色谱峰分离情况：① 70 °C 保持 1 min，以 40 °C/min 的速率升温至 250 °C，以 10 °C/min 的速率升温至 280 °C，保持5 min，再以 20 °C/min 的速率升温至300 °C，保持 1 min；② 70 °C 保持 1 min，以20 °C/min 的速率升温至 210 °C，保持 1 min，以10 °C/min 的速率升温至 280 °C，保持 3 min，以20 °C/min 的速率升温至 300 °C ，保持 2 min。结果发现：使用升温程序①虽然可以缩短分析时间，但在 10～15 min 内，多数化合物出峰较为集中，应对复杂基质时，会降低色谱柱的分离度，虽然能够通过各化合物的特征离子加以区分，但增加了后期方法设置选择离子的难度。②中将升温速率由 40 °C/min 降为 20 °C/min，同时延长最后一阶升温程序的保持时间，则可使沸点较高的化合物尽量流出，因此使用升温程序②。

2.1.2 质谱参数的优化 离子源温度会影响离子化效率，比较了离子源温度 220 °C 和280 °C 的出峰情况。结果发现：离子源温度由220 °C 升高到280 °C 时，化合物的出峰个数和响应值均有所提高，同时为防止离子源受到污染，降低离子源维护频率，离子源温度设定为280 °C。

“起来，起来，快起来，狗日的，没被鬼子炸死，也被你们这帮兔崽子压死！”赵锡田翻了身，事发突然，他被压在最下面啃了一嘴泥，那顶呢制将帽也不知滚到哪去了。

传输线是经色谱柱分离后的化合物进入离子源的通道，可为离子源提供可供电离的气化态分子，比较了传输线温度为260 °C 和280 °C 的出峰情况。结果表明：二者差别不大，为防止这些气化态分子在到达离子源前产生冷凝，因此传输线温度设为280 °C。

合适的特征离子可以避开背景干扰、降低检出限，提高检测灵敏度。通过 NIST 质谱数据库检索目标化合物的特征离子峰，利用多反应监测模式 (MRM) 获取各化合物的碰撞能和保留时间，选择离子丰度强、质荷比大的 3 个特征离子作为母离子，采用 MRM 通过一定的碰撞能将其打碎，进行产物离子扫描，使其裂解成具有一定质荷比的产物离子，选择峰型对称，特征性强、响应值高的3 个离子作为子离子。优化后 99 种农药全扫描总离子流图见图1，质谱分析参数见表1。

图1 99 种农药在 MRM 模式下的总离子流图Fig.1 The total ion chromatogram in MRM mode of the 99 pesticides

2.2 样品前处理条件优化

2.2.1 提取条件 欧盟15662 方法[20]和美国AOAC 2007.01 方法[21]分别以乙腈和乙腈-乙酸作为提取剂，本试验以干红枣基质为例，比较了乙腈和乙腈 + 0.1% 乙酸作为提取溶剂时目标农药的回收率。结果表明：在100 μg/kg 添加水平下，以乙腈和乙腈 + 0.1% 乙酸做提取溶剂时，农药的平均回收率分别为115%、124%，使用乙腈做提取溶剂满足农药残留分析回收率在70%～120%的要求[22]，因此选择乙腈作为提取试剂。图2 显示了分别采用上述两种溶剂提取时，农药的回收率情况。

图2 两种提取溶剂对农药回收率的影响 (re：回收率)Fig.2 Effect of 2 extraction solvents on recovery of 99 pesticides (re means recovery)

2.2.2 盐析剂选择 为增加盐析效应和加速水相与有机相的分离，考察了2 mL 提取液中分别使用2 g 无水硫酸镁 + 0.5 g 氯化钠和5 g 氯化钠对回收率影响。结果表明：在100 μg/kg 添加水平下，同时使用无水硫酸镁 + 氯化钠的平均回收率低于单独使用氯化钠时的回收率，且无水硫酸镁使用前需高温烘烤，成本较高，因此最终采用氯化钠作为盐析剂。

2.2.3 净化剂选择 以干红枣基质为例，采用单因素试验，在 100 μg/kg 添加水平下，考察了 2 mL提取液中不同净化剂对农药回收率的影响。先分别优化 NH2和 PSA 用量，再将C18/GCB 与之组合，考察混合后净化效果。

比较了 NH2净化剂用量 (25、50、75、100、150 和200 mg) 与 PSA 用量 (25、50、75、100、150 和200 mg) 对回收率的影响。 结果发现：使用NH2净化剂时，回收率在 70%～120%的农药比例分别为 28%、32%、31%、79%、62%和57%，即 NH2净化剂用量在 100 mg 时，回收率在 70%～120% 的农药种类最多。使用 PSA 净化剂的回收率情况如图3 所示，当 PSA 用量为 50 mg 时，平均回收率最高。因此确定 PSA 最佳用量为 50 mg。

图3 不同PSA 用量对空白干红枣基质添加回收率的影响Fig.3 Effect of the amount of PSA on recovery in blank dried dates

用类似方法确定杏、葡萄、香梨基质中 PSA最佳用量分别为 25、25 和50 mg。鉴于NH2净化剂在本阶段多个用量范围表现出的低回收率，此处未进一步探究其余 3 种基质的最佳用量。

为去除类胡萝卜素、叶绿素等色素类杂质，在PSA 和C18用量分别为50 mg 和25 mg 条件下，比较了GCB 用量分别为0、5、10 和15 mg时99 种农药在干红枣基质中的平均回收率。结果发现，回收率在70%～120% 的农药比例分别为81%、70%、38% 和40%，即随着GCB 用量增加，方法的准确性降低，符合要求的农药比例越来越少；当GCB 用量大于10 mg 时，滴滴涕、六六六、六氯苯、百菌清、五氯硝基苯和异菌脲等农药回收率显著降低。此外，虽然GCB 用量为 0 mg时回收率最高，但净化后溶液颜色相比GCB 用量为5 mg 时深。为降低设备维护频率，确定干红枣基质中GCB 最佳用量为5 mg。用类似方法确定杏、葡萄、香梨基质中GCB 最佳用量均为0。

2.2.4 净化方法选择 使用传统SPE 净化方法与不同净化剂组合的方法，对比净化效果 (仍以干红枣基质为例)。

方法1： Carb/NH2固相萃取柱净化(SPE)：按照标准方法[18]净化。

方法2： 使用 NH2100 mg + C1825 mg + GCB 5 mg 混合净化剂。

方法3： 使用 PSA 50 mg + C1825 mg + GCB 5 mg 混合净化剂。

经比较：方法 1、2、3 中，99 种农药的平均回收率分别为 104%、89%和100%，回收率在 70%～120% 的农药比例分别为 60%、74%、81%。方法1 与方法 3 平均回收率相差不大，虽然使用 Carb/NH2固相萃取柱在净化效果上略胜一筹，表现为净化溶液更透明，在干红枣这类高糖、低含水量的复杂基质中，除去色素的净化效果更好，但相比方法 3 更耗时费力，需要更多的甲苯作溶剂，成本更高；从回收率符合范围内的农药比例看，使用 100 mg 的 NH2净化剂与使用 50 mg 的 PSA净化剂未呈现明显差别，反映出二者具有相似的吸附特性，这可能与他们的结构类似有关，在满足回收率要求前提下，其用量比 PSA 更多 (该用量恰好是 PSA 用量的 2 倍)，且不同 NH2用量对回收率结果影响较大，方法稳健性相比使用 PSA略显不足。NH2净化剂结构中只有一个氨基，而PSA 净化剂结构中含有两个氨基，离子交换能力相比 NH2净化剂更强。此外 NH2净化剂在处理亚胺硫磷、乙酰甲胺磷等有机磷类目标物时，相比PSA 净化剂表现为更低的回收率。方法 3 采用PSA + C18+ GCB 混合净化剂能够满足检测要求，且回收率相比方法 2 更稳定，当处理杏、葡萄、香梨基质时，符合回收率要求 (70%～120%) 的化合物数量相比使用方法1 更多。因此选择方法 3。3 种净化方法的回收率以及回收率在 70%～120%的农药占比情况见图4。

图4 3 种净化方法对农药回收率的影响 (re：回收率)Fig.4 3 cleaning-up methods on recovery of 99 pesticides(re means recovery)

2.3 基质效应的考察

按照方法 3，分别考察 4 种基质的基质效应，结果表明：在红枣(干)、杏、葡萄、香梨 4 种基质中，均至少有 85% 的农药体现为基质增强效应。干红枣基质中，具有强、中等、弱基质效应的农药分别有 84 、8 、7 个；杏基质中分别有89、5、5 个；葡萄基质中分别有56、36、7 个；香梨基质中分别有76 、17 、6 个。此外，α-六六六、γ-六六六、δ-六六六等农药在4 种基质的基质效应均表现为弱基质效应，上述农药受基质干扰的影响不大。干红枣基质中，因水分含量低，含糖量高，具有基质增强效应的农药比例相比葡萄、香梨基质的更高。因此，在定量分析中根据样品类型分别选择对应的空白基质，采用基质匹配校准方法以降低基质效应。

2.4 方法的线性范围和定量限

分别向红枣 (干)、杏、葡萄和香梨空白基质溶液中添加一定量的标准溶液，配制成质量浓度分别为 0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.2 和0.5 mg/L 的基质匹配混合标准工作溶液，按照 1.2.1节条件、方法 3 测定，以各化合物的定量离子对的峰面积为纵坐标、对应的质量浓度为横坐标绘制标准曲线，以各农药信噪比为 10 时的浓度计算定量限 (LOQ)。结果 (表2) 表明：99 种农药在0.005～0.5 mg/L 范围内均成良好的线性关系，决定系数 (R2) 均大于0.99， LOQ 在 0.01～0.025 mg/kg之间。

表2 99 种农药分别在红枣(干)、杏、葡萄、香梨基质中的定量限、决定系数、回收率和相对标准偏差(n = 5)Table 2 The limit of quantification (LOQ), determination coefficients (R2), recovery (Re) and relative standard deviation (RSD) of the 99 pesticides in dried red dates, apricots,grapes and pears (n = 5)

续表2Table 2 (Continued)

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2.5 方法的正确度与精密度

分别向空白红枣 (干)、杏、葡萄和香梨中添加 0.01、0.025、0.05 和 0.1 mg/kg 4 个水平的混合标准溶液，每个水平重复 5 次，计算回收率和相对标准偏差 (RSD)。结果 (表2) 表明：4 种基质总体平均回收率和 RSD 分别为：60%～138%，0.3%～20%，其中 95 种农药的回收率在 70%～120%，占总数的 96%，表明方法的正确度和精密度基本满足相关法规限量要求[22]，可以用于上述农药残留的日常筛查与检测。

2.6 实际样品检测

利用所建立的方法，对采自本地市场、超市的89 份样品 (包括11 份干红枣，17 份梨，19 份杏，16 份桃，6 份李，20 份葡萄) 进行分析，结果 (表3) 发现有64 份样品检出农药残留，检出频率较高的农药有：氯氰菊酯、啶虫脒、氯氟氰菊酯、毒死蜱等，最高检出量分别为0.38、0.28、0.18、0.056 mg/kg。其中24 份样品检出氯氰菊酯(检出率27%)，20 份样品检出啶虫脒 (检出率22%)，17 份样品检出氯氟氰菊酯 (检出率19%)。葡萄和桃中农药检出率较高，在同一份样品中同时检出 6 种农药。上述农药均未超出我国标准GB 2763—2021 规定的最大残留限量。

表3 99 种农药在实际样本中的检出情况表Table 3 The detection results of 99 pesticides in real samples

3 结论

对比分析了传统 SPE 方法与分别使用 NH2+C18+ GCB 和 PSA + C18+ GCB 分散固相萃取方法的净化效果差异，通过净化剂条件优化，建立了红枣 (干)、杏、葡萄和香梨 4 种果品基质中 99 种农药的气相色谱-串联质谱分析方法。样品用乙腈提取，氯化钠盐析，提取液最终经 PSA、C18、GCB 净化。其中，干红枣 (干果基质) 采用 PSA 50 mg + C1825 mg + GCB 5 mg 净化；杏 (核果基质) 和葡萄 (浆果基质) 采用 PSA 25 mg + C18+10 mg 净化；香梨 (仁果类基质) 采用 PSA 50 mg +C1810 mg 净化，样品经丙酮转溶后采用 GCMS/MS 检测。与已报到的水果中的农药残留测定的多数方法相比，本方法扩展了农药的检测范围，实现了单次进样，22 min 内完成全部分析，灵敏度、正确度和精密度均满足农药残留分析测定和限量要求，操作简单，成本低，可作为快速筛查和确证方法，用于上述基质日常样品农药残留量的分析。