高效液相色谱-串联质谱法测定13 种甲氧基丙烯酸酯和三唑类杀菌剂在杧果中的残留及膳食摄入风险评估

段 云, 关 妮, 马 晨, 陈棠钻, 罗金辉, 魏 静

(1.中国热带农业科学院 分析测试中心，国家市场监管重点实验室 (热带果蔬质量与安全)，农业农村部热作产品质量安全风险评估实验室 (海口)，海南省热带果蔬质量安全重点实验室，海口 571101；2.广西科学院国家非粮生物质能源工程技术研究中心，南宁 530007；3.海南省食品检验检测中心，海口 570314)

杧果是我国四大热带水果之一，主要种植于海南、广西、云南、四川、广东、福建和台湾等地区。热带和亚热带湿热气候常导致杧果生产中病虫害频发，杧果炭疽病、细菌性角斑病和露水斑病等主要病害在果期的发生率分别高达60%以上[1-2]，其中炭疽病尤为突出。杧果炭疽病是由胶孢炭疽菌Colletorichum gloesporioidesPenz 侵染引起的真菌病害，主要为害杧果叶片、嫩梢、花和果实，造成生长期叶斑、梢枯、落花和落果，其潜伏性侵染特性也是导致果实贮藏期间腐烂的重要原因[3]。2019—2020 年实地调研了解，杧果炭疽病作为潜伏性病害在采前发病率较高，为减少经济损失，生产者通常会使用甲氧基丙烯酸酯、三唑类等杀菌剂进行防治。

甲氧基丙烯酸酯和三唑类杀菌剂是防治杧果炭疽病常用化学药剂，具有高效、广谱抗菌、内吸性强和持效期长等特点，是全球销售额 (2014 年)居前2 位的杀菌剂产品类型[4]。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂作用机制是通过阻止电子从细胞色素b 到细胞色素c1之间的传递，阻碍三磷酸腺苷的产生，抑制线粒体的呼吸而产生抑菌作用[5]。三唑类杀菌剂是通过三唑环与病原菌中铁卟啉中心铁源自配位，阻碍铁卟啉铁氧络合物的形成，影响病菌细胞膜的发育从而导致子囊菌、半知菌、担子菌等真菌异常生长，实现防病治病[6-7]。

高度的化学稳定性和较长的半衰期，导致甲氧基丙烯酸酯和三唑类杀菌剂在食品中的质量安全隐患。研究表明，苯醚甲环唑在云南和海南两地杧果中的半衰期达13.2 d 和10.6 d[8]，戊唑醇在葡萄中的半衰期为9.9 d～12.2 d[9]。安徽、江苏、浙江和福建等4 个省份芹菜和番茄中三唑类杀菌剂苯醚甲环唑的检出率分别为23.1% 和20.4%，黄瓜中的抑霉唑检出率为16.3%，其中黄瓜对三唑类杀菌剂累积暴露量贡献最大[10]。

为探明甲氧基丙烯酸酯和三唑类杀菌剂在我国鲜食杧果中的残留水平及膳食摄入风险，本研究基于实地调研，以杧果生产上使用的8 种甲氧基丙烯酸酯类和5 种三唑类杀菌剂为对象，建立了高效液相色谱-串联质谱分析方法，应用于我国杧果主产区和消费市场1056 份全果样品的残留分析，并运用点评估法对13 种杀菌剂开展儿童和成人的长期和短期膳食摄入风险评估，旨在探明我国杧果产品中农药残留的潜在健康危害程度从而有针对性地开展质量安全监管和生产过程风险控制提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 杧果样品 2019—2020 年，在海南、广西、云南和四川等杧果主产区和消费城市 (北京、上海、杭州、南京和西安等) 采集杧果主栽品种(台农、贵妃、金煌、桂热82 号和凯特等)果实，共计1056 份。样品采集后立即置于聚乙烯封口袋中，24 h 内进行全果去核、切块、匀浆，于 -20 ℃冷冻保存，备用。

1.1.2 药剂及试剂 13 种杀菌剂标准品：吡唑醚菌酯、嘧菌酯、醚菌酯、肟菌酯和啶氧菌酯5 种甲氧基丙烯酸酯杀菌剂，苯醚甲环唑、戊唑醇、丙环唑、腈菌唑、氟硅唑、腈苯唑、氟环唑和三唑醇8 种三唑类杀菌剂，均为混标乙腈溶液100 μg/mL，天津阿尔塔科技有限公司。QuEChERS前处理试剂盒盐包 (含1.5 g 乙酸钠和6.0 g 硫酸镁), QuEChERS Extract Pouch, AOAC Method, 美国Agilent 公司；色谱纯甲酸、甲醇和乙腈，美国Fisher 公司；Milli-Q 净化系统经0.22 μm 滤膜过滤的纯净水。

1.1.3 主要仪器设备 SCIEX 高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪Triple QuadTM6500 配备电喷雾离子源(ESI) 和 Analyst®1.7 工作站、定量软件SCIEX OS-Q 1.4.0.180 67 版本，美国AB Sciex 公司；Zorbax Eclipse Plus C18(2.1 mm × 50 mm，1.8 μm)色谱柱，美国Agilent 公司; Tekmar AutoMate-Q40 全自动QuEChERs 样品前处理平台，美国Tekmar 公司；电子分析天平 (0.01g)，梅特勒-托利多国际贸易 (上海) 有限公司。

1.2 分析方法

1.2.1 样品前处理 杧果匀浆样品解冻后，准确称取10.0 g 样品于50 mL 聚丙烯离心管中，依次加入1 份QuEChERS 试剂盒盐包 (7.5 g) 和20.0 mL乙腈，置于全自动QuEChERs 样品前处理平台上，上下振荡10 min 后，于4000 r/min 下离心5 min；取1 mL 上清液与50% 甲醇水按体积比1 : 1 定容，经0.22 μm 有机微孔滤膜过滤，待测。

1.2.2 检测条件

色谱条件：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱(2.1 mm × 50 mm，1.8 μm)，流动相为甲醇和1 mmol/L 甲酸水溶液二元梯度洗脱；柱温40 ℃；样品室温25 ℃；流速0.25 mL/min；进样量2 μL。梯度洗脱程序如表1 所示

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

质谱条件：正离子电离模式 (ESI+)，多反应监测 (MRM) 模式; 离子化 (IS) 电压5.5 kV；离子源温度 550 ℃；气帘气 (CUR) 276 kPa；碰撞气 4 kPa离子源气体1 和气体2 压力均为345 kPa；碰撞能量 (CE) 和去簇电压 (DP) 等参数见表2。

表2 多反应监测模式下的质谱参数Table 2 Mass spectrum parameters in MRM mode

1.3 标准溶液配制及标准曲线绘制

准确量取1.0 mL 标准品溶液，用乙腈稀释，配制成13 种农药的混合标准储备液10 μg/mL，于-18 ℃避光保存。再用乙腈将混合标准储备液稀释，配制成1、5、10、25、50 和100 ng/mL 的混合标准工作溶液。空白杧果样品按照1.2.1 节方法进行前处理后作为基质液，加入不同体积的混合标准工作溶液，配制成基质匹配标准工作溶液，以基质标准工作溶液的质量浓度为横坐标，对应化合物定量离子对峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.4 添加回收试验和基质效应

1.4.1 添加回收试验 称取10.0 g 杧果空白样品，分别加入1、5、10、50 和100 μL 质量浓度为10 μg/mL 混合标准储备液，按照1.2.1 节的方法进行前处理，每个浓度平行测定5 次，计算平均回收率及相对标准偏差 (RSD)。

1.4.2 基质效应 杧果中存在有机酸、糖和色素等物质，可能与待测农药产生相互作用，对农药化合物在质谱离子源形成带电离子时产生增强或减弱的基质效应，从而影响定量分析的准确度和重现性。基质效应 (Me) 按公式 (1) 计算，通常正值表示基质增强，负值表示基质抑制。当基质效应在 -20% ≤Me≤ 20% 时，为较低程度的基质干扰；当 -50% ≤Me＜ -20% 或20% ＜Me≤50%时，为中等程度的基质干扰；当Me＜ -50%或Me＞ -50%时，为强烈程度的基质干扰[11]。

其中，A为某农药在基质溶液中的质谱响应值；B为某农药在纯溶剂中的质谱响应值。

1.5 膳食摄入风险评估

1.5.1 长期摄入风险 长期暴露通常是指基于整个生命周期某物质低剂量的暴露，通过计算每日摄入的食物来源中某种物质摄入量，并将实际每日估算摄入量 (EDI) 与每日允许摄入量 (ADI) 进行比对，如果大于100%ADI 则表示存在长期暴露风险，小于100%ADI 表示长期暴露风险在可接受范围[10]。长期膳食暴露计算公式 (2) 和 (3)：

式 (2) 中EDI 表示食品中某化合物的每日摄入量估计值mg/kg(bw)；CONCi为第i种食品中某化合物的污染值，mg/kg；CONSi为第i种食品的平均消费量，g/d；PFi为第i种食品的加工因子，bw 为体重，kg，式 (3) 中RQ 为长期暴露风险商。

1.5.2 短期摄入风险 短期暴露通常是针对已制定急性参考剂量 (ARfD) 的化合物，在特定人群中短期内 (一餐或24 h 内) 的膳食暴露。ARfD 表示短期内通过膳食和饮水摄入的化合物，不会对消费者产生可观察到健康风险的剂量[12]。自1997 年JMPR (Joint Meeting of Pesticide Residues) 引入了评估农药残留的短期膳食暴露方法后，对评估的方法学进行了细化，将短期暴露评估分为4 种情况[13]，其中鲜食杧果的短期暴露属于情形2a，即每餐份原料食品单位可食部质量小于大份额食品质量[12]，也就是每餐份杧果可食部分质量小于杧果大份额消费量的情况。短期膳食暴露按公式 (4)和 (5) 计算。

式 (4) 中，IESTI 表示食品中某化合物的短期膳食摄入估计值mg/kg(bw)； LP (kg) 为某食品的大份额消费量，指每日消费量的高 (P97.5) 百分位数；Ue(kg) 是以可食部分计的产品单个平均质量由产品单个质量和可食部分百分比计算得到；HR(mg/kg) 为基于规范田间残留试验得到的复合样品可食部分最高残留值或食品中某化合物监测数据的高残留值(97.5th百分位点)；v为变异因子，表示一批产品中不同个体或同一个体中不同部位的平均残留值与最高残留值之间的差距，一般取3。式 (5) 中，%ARfD 表示短期膳食暴露风险商，值越小风险越低，当%ARfD 大于100%时风险不可接受[13]。

2 结果与分析

2.1 方法有效性评价

结果(表3)显示：吡唑醚菌酯等13 种杀菌剂在质量浓度1～100 μg/L 范围内其峰面积与对应化合物的质量浓度间呈现较好线性关系。添加回收试验结果表明：在1、5、10、50 和100 μg/kg 添加水平下，13 种杀菌剂的平均回收率在76%～122%之间，相对标准偏差0.7%～14% (n= 5)。该方法的检出限 (LOD) 为1 μg/kg， 定量限 (LOQ)为5 μg/kg，符合农药残留检测要求[14]。

表3 13 种杀菌剂的线性方程、决定系数和定量限(线性范围：1～100 ng/mL)Table 3 The linear equation, coefficient of determination and LOQ of 13 fungicides (Linear range: 1-100 ng/mL)

杧果中13 种杀菌剂的基质效应如表4 所示：5 种甲氧丙烯酸酯类杀菌剂的Me在 -16.6%～23.6%，除吡唑醚菌酯在1 μg/L 时(Me= 23.6%)属于中等程度的基质干扰外，其余4 种均为较低程度的基质干扰，8 种三唑类杀菌剂的Me在 -13.1%～17.5%之间，均属于较低程度的基质干扰。研究表明，当基质效应为较低程度时，可省去配制基质标准溶液的步骤，直接使用溶剂标准溶液进行定量[15]。

表4 13 种杀菌剂在杧果中的平均添加回收率、相对标准偏差和基质效应 (n = 5)Table 4 Recovery, RSD and Me of 13 fungicides in mangoes at 5 different spiked levels (n = 5)

2.2 杧果中甲氧基丙烯酸酯和三唑类杀菌剂残留分析

1056 份杧果样品中13 种杀菌剂的检出率如图1所示，其中吡唑醚菌酯 (22.6%) 和嘧菌酯 (18.5%)在甲氧基丙烯酸酯类中检出率较高，苯醚甲环唑(15.5%) 和戊唑醇 (4.9%) 在三唑类中检出率较高。

图1 杧果中13 种甲氧基丙烯酸酯和三唑类杀菌剂的检出率 (2019—2020)Fig.1 The detection rate of 13 strobulurin and triazole fungicides in mango samples (2019-2020)

单份样品中的农药多残留情况能反映出生产者在种植过程中的农药使用习惯，也可以评估潜在的毒性累积效应[10]。杧果全果中两类杀菌剂的多残留情况如图2 所示，单份样品中甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂检出1 种占26.3%，2 种占8.2%，3 种及以上占0.7%，最多检出4 种，其中共残留比例最高的是吡唑醚菌酯与嘧菌酯组合，其次为吡唑醚菌酯与肟菌酯组合。单份样品中三唑类杀菌剂检出1 种占16.9%，2 种占2.7%，3 种及以上占0.6%，3 份样品中共检出4 种，共残留比例最高的是苯醚甲环唑与戊唑醇组合。

图2 杧果中甲氧基丙烯酸酯类(a)和三唑类(b)杀菌剂多残留情况Fig.2 The percentage of detected strobulurin (a) and trizole (b) fungicides in mangoes

表5 为杧果样品中13 种杀菌剂的残留水平、我国杧果的残留限量 (MRL)标准[16]、超标率和国际食品法典委员会(CAC)[17]、欧盟[18]及其他国家的残留限量 (美国[19]、日本[20]、韩国[21])。依据我国GB 2763—2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》[16]判定，吡唑醚菌酯、苯醚甲环唑、戊唑醇、嘧菌酯和啶氧菌酯等5 种杀菌剂在杧果样品中的超标率分别为6.9%、2.1%、1.0%、0 和0，另外8 种杀菌剂因未制定MRL 而无法判定。相比较，我国杧果吡唑醚菌酯残留限量较为严格 (0.05 mg/kg)，CAC 和欧盟已于2019 年将吡唑醚菌酯制定临时参考限量 (0.05 mg/kg)，按照既定的程序，重新评估后为0.6 mg/kg，若参考CAC限量对杧果中吡唑醚菌酯的残留再次判定，其超标率仅为0.2%。另外，1056 份样品中检出的醚菌酯、氟硅唑和丙环唑3 种杀菌剂在我国杧果中暂未制定限量，若参考CAC、欧盟和韩国的限量标准判定，分别有0.6% (醚菌酯，CAC 0.1 mg/kg)、0.3% (氟硅唑，欧盟0.01 mg/kg) 和0.2% (丙环唑，韩国0.3 mg/kg) 超标。

表5 杧果中甲氧基丙烯酸酯和三唑类杀菌剂的残留和超标情况Table 5 The residue level and violation rate of strobilurin and triazole fungicides in mangoes

2.3 膳食摄入风险评估

杧果中13 种杀菌剂长期和短期膳食摄入风险评估结果如表6 所示，5 种甲氧基丙烯酸酯和8 种三唑类杀菌剂的ADI 值在0.01～0.4 mg/kg (bw)[21]，已制定ARfD 的9 种杀菌剂急性参考剂量在0.02～0.3 mg/kg(bw)。当13 种杀菌剂残留值低于LOD时统一赋值1/2 LOD[22-23]。

表6 杧果中甲氧基丙烯酸酯类和三唑类杀菌剂对不同人群的短期和长期膳食摄入风险Table 6 The long-term and short-term exposure risk of strobilurin and triazole from the dietary of mangoes for subgroups

2.3.1 长期膳食摄入风险评估 基于点评估方法[24]。运用1.5.1 节公式 (2) 分别将13 种杀菌剂50th百分位数的残留值，参照WHO CiFoCoss (Chronic Individual Food Consumption Database-Summary Statistics) 数据取我国不同人群杧果的平均消费量[25]，加工因子设为1，成人和儿童体重分别按照60 kg 和15 kg 计，计算杧果中杀菌剂残留的长期摄入风险。值得一提的是，开展长期膳食上风险评估需考虑某农药化合物从所有摄入食品中的来源，而不仅是某一种食品，因此运用杧果中13 种杀菌剂的残留数据代入公式 (2) 计算，并不能代表杀菌剂残留的长期摄入风险评估结果，仅表示杧果摄入吡唑醚菌酯等13 种杀菌剂的残留对长期膳食摄入风险商RQ 的贡献率(RQ%)[24]。评估结果显示，通过杧果摄入甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留量对长期膳食摄入风险商的贡献率在儿童和成人中分别为0.01%～0.1%和0.01%～0.2%，三唑类杀菌剂分别为0.01%～0.3%和0.1%～0.5%。

2.3.2 短期膳食摄入风险评估 运用1.5.2 节公式(4)，杧果中杀菌剂残留值数据的97.5th百分位数作为HR (杧果监测数据量充足)，参考荷兰一般人群 (＞1 岁) 杧果LP 膳食数据0.432 0 (kg/d) 和Ue值(以可食部分计的产品单个质量) 0.288 8 (kg)[26](我国暂无杧果LP 膳食数据)，成人和儿童体重分别按照60 kg 和15 kg 计，计算杧果中9 种杀菌剂的短期摄入风险。评估结果显示，杧果中2 种甲氧基丙烯酸酯杀菌剂残留在儿童和成人中的短期膳食摄入风险商 (%ARfD) 分别为0.1～28.9 和0.02～7.2，7 种三唑类杀菌剂分别为0.02～4.1 和0.01～1.0。嘧菌酯、醚菌酯、肟菌酯和氟环唑4 种杀菌剂属于没有必要制定ARfD 的化合物，无需计算其短期摄入风险。

3 讨论与结论

3.1 13 种杀菌剂在杧果上的登记和残留限量制定情况

截至2022 年7 月，经查询中国农药信息网(http://www.icama.org.cn/)，有效期内登记用于防治杧果炭疽病、细菌性黑斑病等病害的农药产品有61 个。本文验证分析的13 种杀菌剂中未登记的有7 种，分别为醚菌酯、丙环唑、腈菌唑、氟硅唑、腈苯唑、氟环唑和三唑醇，在杧果中检出率为0.1%～1.5%。从我国是否已制定残留限量标准看，已登记但未制定残留限量标准的农药有肟菌酯，既未登记又无残留限量标准的农药有丙环唑、腈菌唑、氟硅唑、腈苯唑、氟环唑和三唑醇。

3.2 膳食摄入风险分析

从儿童和成人的膳食暴露风险评估结果看，杧果中13 种杀菌剂残留的RQ%分别为0.01～0.3和0.01～0.5，9 种杀菌剂的%ARfD 分别为0.02～28.9 和0.01～7.2，%ARfD 相对突出的为吡唑醚菌酯，在儿童和成人中分别为28.9 和7.2，但均在风险接受范围内。依据GB 2763—2021[16]，吡唑醚菌酯在我国蔬菜和水果中已制定残留限量标准66 项次，产生膳食摄入风险的食品来源较多，在杧果中其RQ%虽然较低，但不能确定其长期膳食风险的可接受程度。

点评估法计算长期和短期膳食摄入风险步骤简便，但评估结果不确定性较高。在短期膳食摄入风险评估方面，由于缺乏我国消费人群数据，参考荷兰人的杧果膳食数据LP 和Ue，增加了评估结果的不确定性。在残留监测数据方面，由于杧果的采样量大，残留数据较为具有代表性，在此条件下运用50th和97.5th百分位点的残留值代替残留中值和最大残留值 (HR) 可有效降低评估结果的不确定性。另外，点评估的方法计算结果通常为点值，缺少不同人群膳食摄入的分布数据，因而评估结果未能反映杧果中杀菌剂残留在不同人群中的风险概率分布情况。

3.3 结论

本研究建立了基于-高效液相色谱-串联质谱技术，杧果中5 种甲氧基丙烯酸酯和8 种三唑类杀菌剂的定量分析方法，并运用此方法对2019—2020年我国杧果主产区和主要消费城市的1056 份杧果全果样品进行测定。样品中吡唑醚菌酯、嘧菌酯、苯醚甲环唑和戊唑醇检出率相对较高，醚菌酯、丙环唑、腈菌唑、氟硅唑、腈苯唑、氟环唑和三唑醇等7 种杀菌剂属杧果中超范围使用农药(未登记)，今后需要加强监管，参考CAC 和欧盟限量标准建议修订吡唑醚菌酯的残留限量，依照我国GB 2763—2021，建议制定肟菌酯的残留限量。我国居民通过食用杧果摄入吡唑醚菌酯等13 种杀菌剂对长期风险商的贡献率(%RQ)较低，9 种有推荐ARfD 的杀菌剂的短期膳食插入风险商(%ARfD) 均在可接受范围。