自制海鹿复方治疗实验小鼠再生障碍性贫血的药效学研究

王利群，文金全，刘延河，孙武霞，张宝娟，李 飞，罗 燕

﹝咸阳彩虹医院（咸阳市儿童医院）1.中医儿科 2.小儿血液科，陕西 咸阳 712000﹞

再生障碍性贫血（aplastic anemia，AA）是一组以骨髓有核细胞增生减低和全血细胞减少，但无异常细胞浸润或骨髓纤维化为特征的骨髓衰竭性疾病[1]。目前AA 的药物治疗仍有一定的局限性，非骨髓移植治疗主要是使用免疫抑制剂[2]，但难以达到血液学的持续缓解及治愈目标，且不良反应多，而将西药与中药联合应用可取得很好的疗效[3-4]。海鹿复方是笔者根据AA 的发病机制及中医组方规律研制而成的，临床用于治疗儿童AA 二十余年，取得了满意疗效。本研究以BALB/c 小鼠建立AA 动物模型，探讨应用海鹿复方等药物治疗小鼠AA 模型对其体重、白细胞、红细胞、血小板、网织红细胞、白细胞介素-4（IL-4）、γ- 干扰素（IFN-γ）、辅助性T 细胞1（Th1）、辅助性T 细胞2（Th2）的影响，为本制剂的临床应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 动物及分组

BALB/c 小鼠80 只，8 ～12 周龄，体重18 ～22 g，清洁级，雌雄各半，实验在西安交通大学动物实验中心进行。采用随机分组法分为8 组：1）空白对照组；2）模型组；3）单纯海鹿复方小剂量组；4）单纯海鹿复方大剂量组；5）黄芪当归组；6）司坦唑醇+ 左旋咪唑（早期治疗AA 的方案）组；7）海鹿复方+司坦唑醇+左旋咪唑（早期中西医结合治疗方案）组；8）阳性组：环孢素A+ 司坦唑醇+ 左旋咪唑（目前治疗AA 的常用方案）组。每组10 只活小鼠。

1.2 药物

1）苯：分析纯，由天津市富宇精细化工有限公司生产，批号：20160305。2）检测IL-4、IFN-γ、Th1、Th2试剂，商用试剂盒。3）海鹿复方：鹿茸、海马、西洋参等粉碎，过80 目筛；黄芪、当归等煎药后分袋包装50 mL，按含生药2 g/mL 放置于冰箱备用。以上中药由陕西省医药公司提供。4）主要仪器：血细胞分析仪：SYsmex-500i，由希森美康医用电子有限公司生产。

1.3 实验方法

将小鼠按性别及体重随机分为8 组（每组10 只）分笼群养，适应饲养1 周后开始建模。按刑海燕等[5]成功建模的方法，将苯剂以2 mL/kg 剂量注射于BALB/c小鼠尾根皮下，每周4 次，共20 次。建模成功后开始治疗给药，空白对照组灌胃生理盐水0.4 mL/10 g，其余各组药物亦按此容积灌胃给药，分别按人和动物的等效剂量（人用量的12 倍）分组给药治疗（海鹿复方小剂量组给药剂量0.4 g/kg，海鹿复方大剂量组给药剂量4 g/kg）。治疗周期为10 d。于最后一次给药2 h后处理动物。眼球取血等量注入2 管中分别行血常规检查、网织红细胞检测及IL-4、IFN-γ、Th1、Th2检测。IL-4、IFN-γ、Th1及Th2细胞因子的检测方法：采用酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒检测，严格按试剂盒说明书的操作流程加血清及试剂反应，以酶标仪检测结果。

1.4 观察指标

观察建模后AA BALB/c 小鼠的存活情况。观察海鹿复方对AA BALB/c 小鼠体重的影响。观察海鹿复方对AA BALB/c 小鼠血液学指标的影响，血液学指标包括白细胞、红细胞、血小板和网织红细胞。观察海鹿复方对AA BALB/c 小鼠IL-4、IFN-γ、Th1、Th2的影响。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件对实验数据进行分析，计量资料以±s表示，行t检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 海鹿复方对AABALB/c 小鼠体重的影响

模型建成后开始给药，连续给药10 d，动物表现为活动基本正常，体重增加，毛色恢复光亮，大、小便正常，无死亡现象。由表1 可见，模型组体重明显低于空白对照组，P＜0.01；各治疗组（除环孢素A+司坦唑醇+左旋咪唑组）体重均高于模型组，P＜0.01。前者证明建立小鼠AA 模型成功，后者提示治疗后改善了小鼠的体重。

表1 海鹿复方对AA BALB/c 小鼠体重的影响（g，± s）

表1 海鹿复方对AA BALB/c 小鼠体重的影响（g，± s）

注：与模型组比较，★P ＜0.05，★★P ＜0.01；与空白对照组比较，※P＜0.05，※※P ＜0.01；当时为节省费用，未做海鹿复方大剂量组与体重间关系的研究。

组别 动物数（N）体重空白对照组 10 26.20±2.82★★模型组 10 16.00±1.79※※海鹿复方小剂量组 10 20.60±4.86★★※※黄芪当归组 10 20.10±3.22★★※※司坦唑醇+左旋咪唑组 10 20.40±4.45★★※海鹿复方+司坦唑醇+左旋咪唑组 10 19.10±2.71★※※环孢素A+司坦唑醇+左旋咪唑组 10 18.20±2.33※※

2.2 海鹿复方对AABALB/c 小鼠血液学指标的影响

模型组小鼠三系减少，网织红细胞减少，与对照组相比，P＜0.01，证明建模成功。各治疗组血液中白细胞计数与模型组比较均显著增加，P＜0.01，其中尤以海鹿复方+ 司坦唑醇+ 左旋咪唑组、海鹿复方大剂量组白细胞升高最为显著，而黄芪当归组、环孢素A+ 司坦唑醇+ 左旋咪唑组白细胞升高相对较差，但与其他治疗组比较无统计学差异（P＞0.05），提示应用海鹿复方治疗AA 的效果优于目前通用的环孢素A+ 司坦唑醇治疗方法。各治疗组血液中血小板计数与模型组相较均显著增加，P＜0.01，其中尤以司坦唑醇+ 左旋咪唑组、海鹿复方大剂量组及海鹿复方+ 司坦唑醇+ 左旋咪唑组血小板升高最为显著，而黄芪当归组、环孢素A+ 司坦唑醇+ 左旋咪唑组血小板升高相对较差。各治疗组血液中网织红细胞计数与模型组相较均显著增加，P＜0.01（仅黄芪当归组P＜0.05），其中尤以环孢素A+ 司坦唑醇+ 左旋咪唑组、司坦唑醇+ 左旋咪唑组、海鹿复方大、小剂量组为著。提示海鹿复方具有良好的促进AA 小鼠造血的作用。各组间红细胞计数变化不大，主要是由于红细胞生存时间长，短期内未显现所致。详见表2。

表2 海鹿复方对AA BALB/c 小鼠白细胞、红细胞、血小板及网织红细胞的影响（± s）

表2 海鹿复方对AA BALB/c 小鼠白细胞、红细胞、血小板及网织红细胞的影响（± s）

注：与模型组比较，★P＜0.05，★★P ＜0.01 ；与对照组比较，※P ＜0.05，※※P ＜0.01。

网织红细胞计数（×109/L）空白对照组 10 7.53±0.64★★ 13.04±0.54 699.90±141.08★★ 0.0145±0.0071★★模型组 10 2.54±0.65 ※※ 8.24±1.34※※ 312.70±117.05※※ 0.0046±0.0021※※海鹿复方小剂量组 10 7.62±2.12★★ 10.46±0.84 592.10±196.83★★ 0.0133±0.0068★★海鹿复方大剂量组 10 8.24±1.62★★ 11.45±0.24 613.20±112.52★★ 0.0156±0.0054★★黄芪当归组 10 6.53±2.01★★ 11.20±0.55 452.30±141.36★★ 0.0120±0.00582★司坦唑醇+左旋咪唑组 10 8.20±1.94★★ 10.06±0.42 770.60±111.60★★ 0.0219±0.0092★★海鹿复方+司坦唑醇+左旋咪唑组 10 9.03±2.63★★※ 12.40±0.60 603.90±109.23★★ 0.0088±0.0016★★环孢素A+司坦唑醇+左旋咪唑组 10 6.92±1.39★★ 11.98±1.20 579.50±141.15★★ 0.0279±0.0113★★※※组别 动物数（N）白细胞计数（×109/L）红细胞计数（×1012/L）血小板计数（×109/L）

2.3 海鹿复方对AABALB/c 小鼠IL-4、IFN-γ、Th1、Th2 的影响

IL-4、INF-γ、Th1、Th2检 测 结果：模 型 组INF-γ、Th1均高于空白对照组，IL-4、Th2均低于空白对照组，P＜0.05。提示模型建立成功。各治疗组INF-γ、Th1均低于模型组，IL-4、Th2均高于模型组，P＜0.05，其中尤以司坦唑醇+ 左旋咪唑组、黄芪当归组、海鹿复方大、小剂量组IL-4 升高、INF-γ 降低最为显著。详见表3。

表3 海鹿复方对AA BALB/c 小鼠IL-4、IFN-γ、Th1、Th2 的影响（± s）

表3 海鹿复方对AA BALB/c 小鼠IL-4、IFN-γ、Th1、Th2 的影响（± s）

注：与模型组比较，★P ＜0.05，★★P ＜0.01 ；与对照组比较，※P ＜0.05，※※P ＜0.01。

组别 动物数（N）IL-4（pg/mL） IFN-γ（pg/mL） Th1（ng/L） Th2（ng/L）空白对照组 10 131.68±4.57 610.99±19.88 69.63±3.55★★ 58.93±1.47★★模型组 10 55.42±5.00※※ 653.31±26.43※ 81.56±3.34※※ 30.94±2.81※※海鹿复方小剂量组 10 105.54±10.87★★※※ 471.47±52.22★★※※ 64.67±7.04★★ 36.22±5.05★★海鹿复方大剂量组 10 114.51±11.35★※※ 466.23±35.62★★※※ 55.52±8.12★★※※ 40.15±4.28★★黄芪当归组 10 118.62±8.62★★※※ 456.32±50.36★★※※ 61.45±8.12★★ 42.16±4.21★※司坦唑醇+左旋咪唑组 10 138.63±10.14※※ 435.98±45.15★★※※ 43.39±5.98※※ 45.61±1.31★※※海鹿复方+司坦唑醇+左旋咪唑组 10 91.36±8.97★★※※ 573.68±13.95★※ 58.53±2.12★★ 43.86±2.59★★※※环孢素A+司坦唑醇+左旋咪唑组 10 86.66±7.85★★※ 550.82±23.80★※ 61.26±3.24★★ 45.39±1.49★★※※

3 讨论

AA 的主要发病机制目前多认为与免疫异常、造血干细胞及造血微环境受损有关。本病属于中医学中“血证”“虚劳”等范畴，主要由于六淫、七情、饮食不节、邪毒等伤及气血脏腑，气虚血虚，阴阳失调，尤其影响到脾、肾及骨髓功能，渐至元气亏损，精血虚少，气血生化不足所致。其病机以“肾虚”为本，以“血虚”为标。我国传统医学在治疗AA 方面具有独特的优势。中医认为，鹿茸、海马为补肾中药，用于治疗AA 主要是基于肾主骨、骨生髓的中医理论基础。现代药理学研究显示，鹿茸、海马中均含有蛋白多肽类成分、氨基酸、无机元素、糖类、生物胺类、甾体类及脂类等成分[6-7]，具有性激素样作用及免疫促进作用[7-8]；海马对羟基脲所造成的肾阳虚小鼠有明显的治疗作用[9]，可增加雌二醇致肾阳虚小鼠红细胞数量、血红蛋白浓度及血小板数量[10]。有报道指出，活性鹿茸可抵抗昆明小鼠环磷酰胺所致骨髓抑制及体重减轻[11]，鲜活鹿茸治疗肿瘤化疗后骨髓抑制有效[12]。这符合AA 的免疫发病机制及临床用雄性激素治疗AA 有效的依据。

免疫机制是AA 发病研究的热点，免疫抑制剂环孢霉素A 及抗淋巴细胞球蛋白对AA 治疗有效是有力的证据，临床治疗重型AA 的有效率达75% ～80%[13]。揭示免疫功能及免疫细胞的活化，产生大量的造血负调控因子IFN-γ 及肿瘤坏死因子-α，尤其是IFN-γ 增高对造血的影响更大[14]，而造血的正调控因子IL-4 减少，前者由Th1细胞分泌，后者由Th2细胞分泌。本组实验显示，各治疗方法均可降低AA 小鼠血液中INF-γ、Th1的含量，增加IL-4、Th2的含量，这与再障饮对AA 模型小鼠造血细胞的影响[15]结果一致。本组尤以司坦唑醇+ 左旋咪唑组、黄芪当归组、海鹿复方大、小剂量组促使IL-4 升高、对INF-γ 降低作用较强，且作用程度超过阳性组环孢素A+ 司坦唑醇+ 左旋咪唑组。这提示海鹿复方及黄芪、当归不仅具有增强免疫功能[7-8]的作用，还具有免疫调节作用，提示海鹿复方及黄芪、当归等是治疗AA 适当、合理的组方。

本实验显示，海鹿复方能增加AA 小鼠的体重，改善其生存质量；海鹿复方能增加AA 小鼠白细胞、血小板、网织红细胞的数量；海鹿复方能增加AA 小鼠外周血中Th2及IL-4 的含量，降低外周血中Th1及IFN-γ 的含量。海鹿复方可作为AA 的一种新的治疗药物。