不同饲养模式对家蚕蚕沙微生物群落结构的影响

2023-03-13邹邦兴张宇靖卿圣环蒋亚明张友洪肖文福周安莲

西南农业学报 2023年12期

邹邦兴,张宇靖,卿圣环,蒋亚明,张友洪,肖文福,周安莲

(四川省农业科学院蚕业研究所,四川南充 637000)

【研究意义】人工饲料养蚕始于20世纪30年代日本[1],而我国则从20世纪60年代开始研究[2],截止目前,人工饲料养蚕技术已在浙江、江苏、广西、四川、山东等18个蚕桑省区示范推广。和传统桑叶养蚕相比,人工饲料养蚕具有省力高效、安全健康和工厂化操作等优势,是蚕桑生产上的一次技术革新。随着人工饲料养殖技术的推广,关于饲料养蚕蚕沙的处理和利用成为行业面临的难题,区别于传统桑叶育,人工饲料养蚕需要从各方面进行成本控制以达到节本增效的目的,而当前人工饲料养蚕过程中产生的蚕沙主要用于水产品养殖或者直接丢弃。蚕沙作为蚕桑生产过程中的大宗副产物,携带大量病原菌,易导致蚕病爆发和造成环境污染[3]。陈春等[4]研究发现,每生产100 kg蚕茧可得蚕沙约600 kg,根据2021年全国蚕茧产量7.172×105t计算[5],年产蚕沙约4.30×106t,约占2022年全国化肥总产量的7.9%。蚕沙中富含叶绿素[6]、β-胡萝卜素[6-8]和氮磷钾[3-4]等元素,因此极具医药和肥料开发价值,如何将其合理利用,已成为行业人员共同面临的问题。【前人研究进展】作为生物界最庞大、最复杂的微生态系统,肠道微生物本身及其代谢产物与人类健康和环境保护息息相关,因此,研究微生物群落结构与宿主和环境之间的关系尤为重要。随着家蚕人工饲料养蚕技术的推广,对饲料和桑叶不同模式饲养下家蚕肠道微生物群落结构的研究已成为热点。桑基鱼塘是我国最早的农业循环利用模式,也是蚕沙利用最成功和最多的典型实例[9],但蚕沙中携带大量病原微生物,如直接利用可能导致病害发生和环境污染,因此,针对蚕沙中大量病原微生物存在,通过对其肠道和蚕沙微生物的研究有助于蚕沙的安全高效利用。荆文辉等[10]研究发现,以日本配方饲料(NOSAN)和自制配方饲料饲养家蚕,家蚕中肠的细菌菌群存在显著差异,NOSAN饲料育家蚕中肠的菌群丰度较高,而桑叶饲育组与自制饲料饲育组的菌群丰度相当。李刚等[11]以蓖麻蚕品种B7为对象,分别喂食蓖麻叶和臭椿叶,肠道微生物检测结果显示,蓖麻叶育和臭椿叶育的蓖麻蚕肠道优势菌表现相似,其菌群结构和组成与其食性存在一定关系。史才娟等[12]通过对各龄期蚕沙中的微生物群落进行检测,发现各龄期蚕沙微生物群落在数量上有差异,但不显著,细菌以3龄蚕的微生物数量最少,2龄与4龄接近,真菌几个龄期间数量差异不大,放线菌以2龄最多,3龄最少。【本研究切入点】前期研究主要集中在家蚕肠道微生物群落结构组成,关于蚕沙微生物群落结构的研究较少。蚕沙作为养蚕过程中的副产物,其产量高,对环境影响大,因此针对蚕沙的处理一直以来是行业研究热点和难点。【拟解决的关键问题】采用Illumina NovaSeq二代测序方法对全龄饲料育和全龄桑叶育不同模式下5龄蚕沙进行细菌群落组成和丰度检测,解析不同饲养模式下蚕沙微生物群落结构组成,为后期蚕沙的无害化处理及综合利用提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 实验设计

共设计全龄饲料育和全龄桑叶育2组,所用蚕品种为“9211·9215×川58·川62”(又名“川蚕30号”),饲养阶段在四川省农业科学院蚕业研究所完成。其中全龄饲料育处理温湿度为1～2龄温度29～30 ℃,湿度90%;3龄温度28～29 ℃,湿度85%,4龄温度26～27 ℃,湿度80%,5龄温度25～26 ℃,湿度80%。桑叶育处理采用自然温湿度,其中1～2龄期温度不低于28 ℃。

1.2 材料采集

2022年秋季收集2种饲养模式下5龄盛食期蚕沙,剔除杂质,然后每个处理5个重复送样,饲料育组样本编号为T1～T5(记作T,作为处理组),桑叶育组样本编号为CK1～CK5(记作CK,作为对照组),然后以干冰保存送至上海派森诺生物科技股份有限公司。

1.3 蚕沙微生物检测

DNA提取、16S rDNA区域扩增、序列测定和文库构建均由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。称取0.2 g蚕沙,提取微生物DNA,利用琼脂糖凝胶电泳进行DNA样品检测。然后对其16S V3～V4区域进行扩增,扩增引物为通用引物F:5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物,目的片段用 Axygen 凝胶回收试剂盒回收并纯化。纯化后产物采用Illumina NovaSeq平台对群落DNA片段进行双端(Paired-end)测序,同时采用DADA2和Vsearch方法进行去引物、质量过滤、去噪、拼接和去嵌合体等步骤以获得高质量的ASV和OTU序列。然后采用QIIME2的classify-sklearn算法对每个ASVs的特征序列或每个OTU的代表序列在QIIME2软件中使用默认参数进行物种注释。

1.4 数据分析

采用WPS 2020进行数据整理,GraphPad Prism 9进行双尾T检验,Origin 2022进行作图。

2 结果与分析

2.1 蚕沙微生物DNA测序结果

从表1可知,桑叶育对照组蚕沙细菌微生物测序在原始数据(Input)、有效序列(Denoised)、拼接后序列(Merged)、去除嵌合体后的高质量序列(Non-chimeric)和去除singleton后的序列(Non-singleton)均比全龄饲料育处理组高,且存在显著差异(P<0.05),但在去除低质量序列(Filtered)上两者差异不显著(P>0.05)。

2.2 蚕沙微生物的OTU聚类分析

通过高通量测序得到桑叶育对照组和全龄饲料育处理组蚕沙微生物的有效序列分别为41 691条和38 604条,使用QIIME2软件在97%相似水平上聚类,通过注释获得2组样本的OTU数目,分别为全龄饲料育处理组1983个、桑叶育对照组529个,2组共有的OTU为133个(图1)。说明全龄饲料育较桑叶育可以增加蚕沙微生物丰度。

图1 不同饲养模式蚕沙微生物OTU聚类Fig.1 OTU cluster of silkworm sand microorganisms in different feeding modes

2.3 蚕沙微生物Alpha多样性分析

2.3.1 Alpha多样性从图2可知,全龄饲料育组和桑叶育对照组文库覆盖率在99%以上,表明所建基因文库能较完整、真实地反映样本蚕沙细菌群落结构。Chao1指数和Observed_species指数反映样本中细菌群落的物种丰富度,其值越大,代表样细菌群落中的物种总数越多;Shannon指数和Simpson指数代表样本细菌群落的物种多样性,其值越大,代表样细菌群落的物种多样性越大;Pielou_e用于反映物种个体数目在群落中分配的均匀程指数。蚕沙细菌群落包含的物种数目在Chao1指数、Observed_species指数和均匀度(Pielou_e)指数的变化趋势一致,均是全龄饲料育处理组数据高于桑叶育对照组,且呈显著差异(P<0.05);在细菌群落多样性方面,Shannon指数和Simpson指数变化趋势一致,均是全龄饲料育处理组高于桑叶育对照组,且呈极显著差异(P<0.01)。说明,全龄饲料育组蚕沙细菌群落的物种数目和物种多样性显著高于桑叶育对照组。

2.3.2 蚕沙微生物Chao1和Shannon稀疏曲线为验证上述所得Alpha多样性测序数据量是否足以反应蚕沙微生物多样性,利用已测得样本各种OTU数绘制稀疏曲线,通过该曲线可以在相同测序深度下,比较样本中OTU数的多少,从而在一定程度上衡量每个样本的物种数目和多样性水平。从图3可知,随着抽样水平增加,蚕沙细菌微生物的Chao1指数和Shannon指数的稀疏曲线呈快速增长到趋于平衡,说明测序量足够大,已基本覆盖样品中所有物种,同时在同一抽样水平上全龄饲料育处理组样本中OTU均高于桑叶育对照组,说明全龄饲料育处理组蚕沙微生物在物种数目和多样性方面均较桑叶育对照组高。

2.4 蚕沙微生物群落结构

2.4.1 不同饲养模式蚕沙微生物物种组成分类单元数通过对抽平后的OTU进行统计,获得每个样本中的微生物群落在域、门、纲、目、科、属、种7个分类水平各自含有的分类单元的数量,统计的数目中已去除包含unclassified、uncultured、uncultivated、unknown、metagenome等字段的分类单元(表2)。在门、纲、目和科分类水平,桑叶育对照组的分类单元数量均较全龄饲料育处理组高;在属(Genus)水平上,两者一致;在种分类水平上,全龄饲料育处理组的分类单元数量较桑叶育对照组高。说明,随着分类单元逐渐细化,桑叶育对照组和全龄饲料育处理组蚕沙在细菌群落各分类水平的单元数量呈先上升后下降趋势,其中桑叶育对照组在科分类水平达到最高值,全龄饲料育处理组则在属分类水平达到最高值。

表1 样本测序量统计

图2 不同饲养模式下蚕沙细菌Alpha多样性Fig.2 Bacterial diversity of silkworm excrement under different feeding modes

图3 蚕沙细菌微生物Chao1和Shannon稀疏曲线Fig.3 Chao1 and Shannon sparse curve of bacteria in silkworm excrement

2.4.2 不同饲养模式蚕沙微生物物种组成分析通过对去除singleton后的特征序列进行统计,实现桑叶育对照组和全龄饲料育处理组蚕沙在门、纲、目、科、属、种6个分类水平上的组成分布。在门水平(图4-A)上,桑叶育对照组蚕沙细菌群落中相对丰度排前3的依次为蓝细菌(Cyanobacteria,55.38%)、厚壁菌门(Firmicutes,32.50%)和变形菌门(Proteobacteria,11.55%);全龄饲料育处理组蚕沙细菌群落中相对丰度排前3依次为变形菌门(Proteobacteria,68.18%)、厚壁菌门(Firmicutes,24.10%)和放线菌门(Actinobacteria,7.28%)。其中厚壁菌门和变形菌门为桑叶育对照组和全龄饲料育处理组蚕沙细菌优势菌门。

在目水平(图4-B)上,桑叶育对照组蚕沙细菌群落中相对丰度大于1%的有肠杆菌目(Enterobacteriales)、木霉菌目(streptophyta)、乳酸杆菌目(Lactobacillales)、芽孢杆菌目(Bacillales)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、伯克氏菌目(Burkholderiales)和立克次氏体目(Rickettsiales),其中相对丰度排前3的依次为木霉菌目(55.24%)、乳酸杆菌目(28.22%)和芽孢杆菌目(4.15%)。全龄饲料育处理组蚕沙细菌群落中相对丰度大于1%的有肠杆菌目(Enterobacteriales)、乳酸杆菌目(Lactobacillales)、芽孢杆菌目(Bacillales)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、放线菌目(Actinomycetales)、伯克氏菌目(Burkholderiales)和其他(Others),其中相对丰度排前3的依次为肠杆菌目(58.90%)、乳酸杆菌目(15.14%)和芽孢杆菌目(8.63%)。乳酸杆菌目和芽孢杆菌目均为桑叶育对照组和全龄饲料育处理组蚕沙细菌目水平优势菌目。

表2 不同饲养模式下蚕沙细菌群落在各分类水平组成

A、B、C、D分别代表在蚕沙细菌群落在门、纲、科、属分类水平;横坐标表示样品分类,纵坐标表示在各分类水平下相对丰度(丰度值前10)。A, B, C and D represent the classification level of the bacterial community in the silkworm excrement at the level of phylum, class, family and genus. The horizontal axis represents sample classification, and the vertical axis represents relative abundance at each classification level (top 10 abundance values).

在科水平(图4-C)上,桑叶育对照组蚕沙细菌群落中相对丰度大于1%的有肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、肠球菌科(Enterococcaceae)、莫拉氏菌科(Moraxellaceae)、小杆菌科(Exiguobacteraceae)、Mitochondria、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)和其他(Others),其中相对丰度排前3的依次为其他(57.94%)、肠球菌科(27.58%)和小杆菌科(3.88%)。全龄饲料育处理组蚕沙细菌群落中相对丰度大于1%的有肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、肠球菌科(Enterococcaceae)、莫拉氏菌科(Moraxellaceae)、细球菌科 (Micrococcaceae)、小杆菌科(Exiguobacteraceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)其他(Others),其中相对丰度排前3的依次为肠杆菌科(58.90%)、肠球菌科(14.04%)和莫拉氏菌科(7.07%)。肠球菌科均为桑叶育对照组和全龄饲料育处理组蚕沙细菌科分类水平优势菌科。

在属水平(图4-D)上,桑叶育对照组蚕沙细菌群落中相对丰度大于1%的有肠球菌属(Enterococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、蝇子草属(Silene)、青枯菌属(Ralstonia)和其他(Others),其中相对丰度排前3的依次为其他(60.21%)、肠球菌属(27.47%)和微小杆菌属(3.58%)。全龄饲料育处理组蚕沙细菌群落中相对丰度大于1%的有肠球菌属(Enterococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、节杆菌属(Arthrobacter)微小杆菌属(Exiguobacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)和其他,其中相对丰度排前3的依次为其他(67.74%)、肠球菌属(13.28%)和不动杆菌属(6.79%)。肠球菌属均为桑叶育对照组和全龄饲料育处理组蚕沙细菌属分类水平优势菌属。

2.4.3 蚕沙微生物物种Beta多样性和物种组成 PCoA分析可以直观观察样本内或样本间的差异,在坐标轴上的投影距离越近,表明样本在相应维度中的群落组成越相似。如图5-A所示,基于Bray-Curtis距离、置信度95%计算聚类,桑叶育对照组和全龄饲料育处理组之间投影距离较大,说明2种饲育模式下家蚕蚕沙细菌物种组成存在差异。为进一步比较样本间的物种组成差异,默认使用平均丰度前20位的科的丰度数据绘制热图,实现2组蚕沙微生物细菌的物种丰度分布趋势的展示,如图5-B所示,在科分类水平上,桑叶育对照组和全龄饲料育处理组样品间菌群结构组成存在一定差异。其中乳杆菌科(Lactobacillaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、小杆菌科(Exiguobacteraceae)、橙单胞菌科(Aurantimonadaceae)、Mitochondria、链球菌科(Streptococcaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)和鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)在桑叶育对照组中相对丰度较全龄饲料育处理组中相对丰度高;肉杆菌科(Carnobacteriaceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、细球菌科(Micrococcaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)、动球菌科(Planococcaceae)、莫拉氏菌科(Moraxellaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)和假单胞菌科(Pseudomonadaceae)在全龄饲料育处理组中相对丰度较桑叶育对照组中相对丰度高;肠球菌科(Enterococcaceae)在2组中相对丰度相对一致。

图5 不同饲育模式蚕沙细菌Beta多样性(A)和在科水平丰度聚类(B)Fig.5 Beta diversity (A) and cluster of abundance at family level(B) of silkworm sand bacteria in different feeding modes

3 讨论

蚕沙的安全利用依然是产业发展过程中面临的难题之一。蚕沙富含多种氨基酸和矿质元素,能够为土壤提供肥力,因此,蚕沙的肥料化利用成为当前蚕沙综合利用中前景较广和用量最多的方向。但蚕沙中携带大量病原微生物,如直接还田利用会造成土壤水体污染和给蚕桑生产带来安全隐患[13],因此在蚕沙肥料化利用过程中需要经过发酵和熟化灭菌处理才能用于土壤肥培管理,增加土壤有机质[13-16],除了为主要农作物[17]和经济作物[18-22]提供肥力外,蚕沙还可用于连作障碍土壤修复[23]、土壤碳库平衡[24]和沼气循环利用[25-26]等。

近年来,随着工厂化全龄人工饲料养蚕技术的推广,关于饲料养蚕蚕沙的综合利用也逐渐成为热点问题,而当前还未见关于全龄饲料育蚕沙微生物群落结构的报道。本研究通过对同一家蚕品种采用不同模式饲养(即全龄饲料育和全龄桑叶育),对其五龄蚕沙进行细菌多样性分析,并比较2种饲养模式下家蚕蚕沙细菌群落结构组成,饲料育较桑叶育能够显著提高蚕沙细菌群落结构的OTU个数、物种数目和物种多样性,其原因可能与饲料组成成分有关,对照组采用桑叶喂食家蚕,其蚕沙细菌群落结构主要受桑叶细菌群落结构影响,全龄饲料育处理组采用人工配制饲料,该饲料主要由桑叶、玉米、大豆、矿物质和少量微量元素组成,从食物来源看,全龄饲料育处理组家蚕取食的食物中细菌菌落结构较对照丰富,这可能是导致全龄饲料育处理组蚕沙细菌群落在物种丰富度和物种多样性方面较桑叶育对照组高的原因之一,具体情况有待进一步验证。此外还可能与养蚕环境、桑叶品种、叶片老熟和桑叶储存环境和储存时长存在一定关系。

全龄饲料育处理组和桑叶育对照组之间的细菌物种组成在相对丰度前20的科分类水平存在一定差异,其中乳杆菌科(Lactobacillaceae)等8种科水平细菌在桑叶育对照组中相对丰度较全龄饲料育处理组高,肉杆菌科(Carnobacteriaceae)等11科水平细菌在全龄饲料育处理组中相对丰度较桑叶育对照高,而肠球菌科(Enterococcaceae)在两组中相对丰度相对一致。肠球菌为需氧或兼性厌氧型,广泛分布于自然环境中,革兰氏阳性,适宜在高盐(6.5%NaCl)、高碱(pH 9.6)和10～45 ℃环境下生长,极易形成耐药性,是造成新生儿败血症的第三病因,因此,在蚕沙的无害化处理过程中应重视肠球菌的灭活处理,避免造成环境污染和影响人类健康。同时样品内部间也存在一定差异,其原因有待进一步研究。在细菌物种分类方面,在门水平上,厚壁菌门和变形菌门均为桑叶育对照组和全龄饲料育处理组蚕沙细菌门分类水平优势菌,其相对丰度分别为32.50%、11.55%和68.18%、24.10%。在目水平上,乳酸杆菌目均为桑叶育对照组和全龄饲料育处理组蚕沙细菌目分类水平优势菌,其相对丰度分别为22.82%和15.14%。在科水平上,肠球菌科均为桑叶育对照组和全龄饲料育处理组蚕沙细菌科分类水平优势菌,其相对丰度分别27.58%和14.04%。在属水平上,肠球菌属均为桑叶育对照组和全龄饲料育处理组蚕沙细菌属分类水平优势菌,其相对丰度分别为27.47%和13.28%。物种分类学结果显示,不同饲养模式下家蚕蚕沙细菌群落结构在门、目、科、属水平上均存在差异(P<0.05),说明不同饲料来源对蚕沙微生物的物种组成和相对丰度有一定影响。