基于UPLC-HESI-MS/MS法的韭菜坪2号烟叶代谢特征分析

2023-03-13申树林顾怀康尹能文孙夫军曹廷茂喻奇伟陈秀娥李彩斌曲存民

西南农业学报 2023年12期

申树林,刘涛,邹焱,顾怀康,何轶,尹能文,孙夫军,曹廷茂,喻奇伟,陈秀娥,李成,李彩斌,曲存民

(1. 西南大学农学与生物科技学院,重庆 400716;2. 西南大学现代农业科学研究院,重庆 400716;3. 贵州省烟草公司毕节市公司,贵州毕节 551700;4. 贵州省烟草科学研究院,贵阳 550000;5. 湖南中烟工业有限责任公司,长沙 410019)

【研究意义】毕节地区具有悠久的烤烟种植历史,是贵州省重要的烤烟种植区。长期以来该地区的烤烟品种多为国内外引进,但由于毕节各地的生态环境差异大,外来引进品种K326、云烟85、云烟87等不能完全适应该地的生态条件,无法形成其烟叶质量的风格特色,导致烟叶生产经济效益低[1]。为提高毕节地区烟叶生产效益,毕节市烟草公司选育了适宜当地的烤烟新品种韭菜坪2号[2]。后续研究表明,与对照材料(红花大金元)相比,韭菜坪2号具有较强的区域适应性[3]。在适宜种植区(如赫章县等),韭菜坪2号比对照材料(K326)具有更高的产量和品质[3-4]。产量方面,韭菜坪2号比对照K326增产100 kg/hm2以上[4]。品质方面,韭菜坪2号烟叶中的糖含量、糖碱比、棕色化反应产物含量较高,杂色烟较少,成熟度较好,香气值较高,相同等级烟叶的总糖、还原糖、淀粉含量高于对照[3-4]。上述研究表明韭菜坪2号是适宜毕节地区的优异品种,然而其在毕节特别是赫章等地的烟叶香型风格特征形成机理尚不清楚。因此对韭菜坪2号进行代谢组分析,有助于全面了解韭菜坪2号烟叶风味形成的代谢基础,为后续解析其烟叶香型风格特征形成机理奠定基础,也为烤烟品种韭菜坪2号在赫章的稳定发展及其他区域的推广应用提供理论依据,同时对高海拔烟区品种结构优化具有重要意义。【前人研究进展】烟叶代谢物是形成烟叶香型风格特征的物质基础,目前认为烟草香气主要受多酚类化合物、萜类化合物和生物碱类化合物的影响[5]。例如,烟叶多酚的组成及含量与烟叶风味紧密相关[6-7];具有合适烟碱含量的烟叶能提供好的香气[8]。多项研究表明烟草多酚、烟碱等代谢物积累水平受土壤、海拔、温度、降雨量等环境因素的影响[9-12]。近年来,随着代谢组技术的成熟,其被广泛应用在烟草研究中[13],如Li等[14]运用代谢组技术发现烤烟叶茎的存在对烟叶中的代谢物质具有显著影响;Zhao等[15]运用代谢组技术发现烟叶打顶后延迟了叶片衰老,促进了烟叶次生代谢物的积累。前人研究表明,相较于传统的化合物检测方法,代谢组可以高通量、更全面地对样本进行代谢物的检测,有助于系统了解烟草代谢变化。【本研究切入点】前人主要通过农艺性状调查、烟叶品质鉴定对韭菜坪2号在毕节地区的适应性进行了分析,但还缺乏其具体适应机制的相关研究。因此,本研究采用液相色谱-质谱联用技术对韭菜坪2号进行代谢组分析,进一步明确韭菜坪2号烟叶的代谢特征。【拟解决的关键问题】通过与对照材料云烟87进行比较,鉴定韭菜坪2号烟叶中的特征代谢物,为从代谢组水平挖掘其适应性机制及烟叶风格形成特征提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

云烟87和韭菜坪2号于2021年种植在赫章县达依(简称DY,海拔1862.77 m,104°42′8″ E,27°10′44″ N)、可乐(简称KL,海拔1925.26 m,104°24′56″ E, 27°11′26″ N)、铁匠(简称TJ,海拔2022.38 m,104°22′10″ E,27°3′15″ N)等3个乡镇,按常规方法进行种植管理。在烟叶打顶后10 d对韭菜坪2号和云烟87的健康植株进行取样,每个材料选取3株长势一致的植株,每株取1片中部烟叶(约倒7～8片叶)混合,依次命名为:JCP_TJ、JCP_KL、JCP_DY、YY_TJ、YY_KL、YY_DY。将烟叶样品放入冻存管中并立即用液氮保存,随后转入-80 ℃超低温冰箱保存用于后续代谢组分析,每组3个生物学重复。

1.2 烟叶代谢物提取

参照Qu等[16]方法,略有改动:将冻存新鲜烟叶研磨成粉末状,称取50 mg粉末,加入1 mL 80%甲醇水溶液(含0.1%甲酸)。采用超声仪(KQ-100E,昆山,中国)4 ℃超声提取1 h,期间涡旋3次。10 000 r/min离心10 min,吸取上清液,经0.22 μm尼龙微孔过滤样本后,保存于上样瓶中,进行UPLC-HESI-MS/MS分析。

1.3 LC-MS/MS条件

参照Qu等[16]方法,略有改动:液相色谱分析使用Dionex UltiMateTM3000 UHPLC system(Thermo Fisher Scientific,USA);ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard预柱(孔径:1.7 μm,2.1×5 mm,Waters,Ireland);Acquity UPLCBEH C18色谱柱(孔径:1.7 μm,2.1×150.0 mm,Waters,Ireland)。流动相为0.1%甲酸水溶液(A)和0.1%甲酸乙腈水溶液(B)。流速为0.3 mL/min,柱温40 ℃,流动相梯度为0～2 min,5%～10% B;2～10 min,10%～25% B;10～15 min,25%～50% B;15～20 min,50%～95% B;20～23 min,95% B;23.0～23.5 min,95%～5% B;23.5～28.0 min,5% B。流速为0.300 mL/min,进样量为10 μL。

质谱分析系统为Thermo ScientificTMQ-ExactiveTM,具体参数为:负离子模式,加热电喷雾电离源(HESI),离子源电压为3.5 kV,毛细管温度为350 ℃,扫描范围为100～1200 m/z。气流参数设置:鞘气(sheath gas)35;辅助气(auxiliary gas)10;反吹气(sweep gas)0。

1.4 数据分析

使用MS-DIAL v4.60对原始离子峰进行提取,同时删除非特异离子峰[17];使用MetaboAnalyst5.0对离子峰进行PCA、差异倍数和t检验分析[18];代谢物鉴定二级质谱数据采用MS-DIAL软件整合的公共数据库,其包含Mass Bank、GNPS等多个质谱数据库(http://prime.psc.riken.jp/compms/msdial/main.html#MSP)。

2 结果与分析

2.1 韭菜坪2号代谢谱分析

利用MS-DIAL v4.60对原始离子峰进行提取,共鉴定到1880个离子峰。所有样本PCA分析结果显示,QC样本聚合紧密,说明LC-MS/MS稳定性较好,获得的数据结果可靠,可用于后续分析。主成分分析结果显示,韭菜坪2号和云烟87在第一主成分水平上显著区分(图1),同时达依、可乐、铁匠3个取样点的样本在第二主成分上也呈现分离。结果表明,韭菜坪2号和云烟87品种烟叶代谢组分具有显著差异,且同一品种的代谢组分受环境条件影响明显。

图1 韭菜坪2号和云烟87的代谢物主成分分析Fig.1 PCA analysis of metabolites between Jiucaiping 2 and Yunyan 87

此外,达依和可乐取样点的样本距离较近且远离铁匠取样点,表明达依和可乐的烟叶生长环境相似,但均与铁匠的生长环境有着较大差异。

2.2 差异代谢物的筛选与鉴定

为筛选出品种之间的差异代谢物,本研究结合差异倍数和t检验两种方法,分别对达依、可乐和铁匠3个点的样品代谢离子峰进行了差异分析。结果显示,韭菜坪2号与云烟87在达依、可乐、铁匠3个取样点分别有397(200个下调,197个上调)、318(166个下调,152个上调)、259个(123个下调,136个上调)差异离子峰(图2-A～2-C)。为排除环境因素的影响,本研究对3个试验点样品中共有差异离子峰进行统计:其中有46个离子峰的丰度在3个试验点的韭菜坪2号中都显著高于对照云烟87,而有49个离子峰的丰度在3个试验点的韭菜坪2号中都显著低于对照云烟87(图2-D、2-E)。在3个试验点中达依取样点的差异离子数量远多于铁匠、可乐取样点。

进一步对3个取样点的共有差异离子进行二级质谱鉴定,在共有上调离子峰与共有下调离子峰中各鉴定到3种代谢物(图3、表1)。其中,在韭菜坪2号中上调积累的化合物M_9637被鉴定为木犀草素7-(6’-丙二酰糖苷)。该化合物为黄酮类化合物,可能参与了韭菜坪2号烟叶独特风味的形成。同时表明韭菜坪2号烟叶中类黄酮代谢水平可能高于云烟87。

2.3 多酚类代谢物的广泛靶向检测分析

多酚类物质对烟叶制品味道和颜色都有积极的影响,是烟叶中重要的次生代谢产物。本研究使用Qu等[16]构建的代谢数据库对样本中的酚酸和类黄酮代谢物进行了定量分析。共检测到37种多酚类代谢物,其含量如图4所示。异属李素、槲皮素在3个取样点的韭菜坪2号中均出现上调积累,其他代谢物在云烟87和韭菜坪2号之间不存在积累差异。异属李素、槲皮素与非靶向分析鉴定的差异上调代谢物木犀草素7-(6’-丙二酰糖苷)均属于黄酮代谢物。上述结果表明,韭菜坪2号烟叶的黄酮代谢水平高于云烟87。

A、B、C分别为达依、可乐、铁匠3个试验点的差异离子火山图,上调表示该代谢物在韭菜坪2号中积累量高;D为韭菜坪2号在3个试验点的上调积累差异离子韦恩图;E为韭菜坪2号在3个试验点的下调积累差异离子韦恩图。A, B and C are the differential ion volcano maps of three experimental sites, DY,KL and TJ, respectively; Upregulation indicates a high accumulation of this metabolite in Jiucaiping 2; D is the venn diagram of the differential metabolites of up-regulated accumulation in Jiucaiping 2 at three experimental sites; E is the venn diagram of the differential metabolites of down-regulated accumulation in Jiucaiping 2 at three experimental sites.

差异上调离子(A～D)与差异下调离子(E～G)二级质谱比对图,红色为数据库参考离子特征峰,黑色为样品中离子特征峰。Secondary mass spectrometry comparison diagram of differentially up-regulated peaks (A-D) and of differentially down-regulated peaks (E-G). Red means the secondary mass spectrum information from database, and black means the secondary mass spectrum information from sample.

表1 差异代谢物信息

图4 37种多酚物质含量热图Fig.4 Heatmap of thirty-seven phenolic compounds contents

2.4 尼古丁和降烟碱含量比较

尼古丁是烟草中决定刺激气味的重要次生代谢物。本研究后续鉴定到尼古丁合成途径的2种下游产物尼古丁和降烟碱,并对其相对离子峰强度进行提取(图5)。在铁匠试验点,韭菜坪2号的尼古丁、降烟碱平均离子强度低于云烟87;在可乐试验点,韭菜坪2号的尼古丁、降烟碱平均离子强度均显著低于云烟87;在达依试验点,韭菜坪2号只有降烟碱平均离子强度低于云烟87。结果表明,韭菜坪2号烟叶的尼古丁积累水平在其中2个试验点(铁匠、可乐试验点)低于云烟87,而降烟碱的积累水平在3个试验点下均低于云烟87,表现出比较稳定的特征。

3 讨论

作物具有丰富的次生代谢产物,这些代谢物广泛参与作物的生命活动,其积累量与环境条件紧密相关。在水稻[19]、苹果[20]等作物中的代谢研究表明,作物驯化过程中会改变其体内代谢物质的积累以适应环境变化,这使得同一作物不同品种对环境的适应性具有差异。本研究中,PCA分析结果显示烟叶代谢物的积累与品种和环境均有密切的关系,特别是韭菜坪2号与云烟87在3个烟叶产区的代谢差异体现了品种对环境的适应性具有差异。在达依产区,2个试验烤烟品种具有最大的代谢差异,因此达依地区可能更能彰显韭菜坪2号的优异特征。

多酚是烟叶中重要的一类次生代谢产物,具有抗非生物胁迫的作用,也是烟叶中重要的香气前体物质,如苯丙氨酸衍生物绿原酸、香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、山奈酚-3-O-葡萄糖苷等[21-24]。Xu等[25]研究发现烟草通过提高类黄酮物质(槲皮素和山奈酚)的积累来响应冷胁迫。本研究发现,不同环境中木犀草素7-(6’-丙二酰糖苷)、异鼠李素和槲皮素3种类黄酮物质均在韭菜坪2号中上调积累。这表明韭菜坪2号为适应赫章地区的环境条件,其类黄酮合成途径比云烟87更为活跃。此外,据前人报道,在卷烟中适量添加蒲公英类黄酮提取液可以使烟气增香和增甜,其中木犀草素在类黄酮提取液中占有较高含量[26],因此木犀草素7-(6’-丙二酰糖苷)高积累的同时可能也改变了韭菜坪2号的烟叶香型风格。尼古丁是烟叶中主要的生物碱,占烟叶总生物碱的90%～95%[27]。同时尼古丁也是烟叶刺激气味的主要因素,尼古丁含量高的烟叶一般为浓香型,含量低的一般为清香型[28-29]。清香型烟叶中过高的尼古丁含量会降低吸评质量[30]。本研究中韭菜坪2号的尼古丁、降烟碱含量低于同为清香型的云烟87。同时云烟87中尼古丁、降烟碱含量在3个取样点之间无明显差异,而韭菜坪2号表现出达依>铁匠>可乐的趋势,充分体现了韭菜坪2号在赫章地区的区域适应性。总的来说,通过代谢分析推测,韭菜坪2号通过类黄酮物质的高积累来适应毕节各地的环境;同时,类黄酮物质高积累与烟碱物质的低积累共同形成了韭菜坪2号的烟叶风味特色。

A、B为尼古丁、降烟碱二级质谱比对图,红色为数据库参考离子特征峰,黑色为样品中离子特征峰;C、D为各试验点烟叶中尼古丁、降烟碱离子峰面积。Secondary mass spectrometry comparison diagram of nicotine (A) and nornicotine (B). Red means the secondary mass spectrum information from database, and black means the secondary mass spectrum information from sample. The peak areas of nicotine (C) and nornicotine (D) in tobacco leaves of each test site.