不同茶树品种新梢氮磷钾含量与根际土壤细菌群落多样性差异

孔垂思,李友勇,孙云南,尚卫琼,刘本英,杨 涛

(1.云南省农业科学院农业环境资源研究所,昆明 650205;2.云南省茶学重点实验室/云南省农业科学院茶叶研究所,云南 勐海 666201;3.云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所,昆明 650205)

【研究意义】茶树是中国重要的经济作物,云南是中国茶树资源最丰富的遗传多样性中心[1],氮、磷、钾是植物生长需求量较大的矿质元素,是植物光合作用顺利进行的物质基础[2],作为叶用植物,氮、磷、钾是茶树的主要营养物质,土壤是茶树生长的保障,良好的土壤肥力是茶叶产量和品质的基础。因此,揭示高氮磷钾含量的不同品种茶树土壤细菌群落多样性形成机制,优化茶树种植技术,对茶产业的发展具有重要作用。【前人研究进展】植物生长调节剂能提高茶新梢的光合效率[3-4],遮荫网构建的微气候、叶面肥喷施、增施有机肥等措施能增加茶新梢的产量和品质[5-7]。同时不同采摘标准对茶新梢的产量和品质影响较大[8],适量增施氮肥、遮荫及有机肥均可提升茶新梢的香味品质[9-10]。良好的根际微生态环境可以提升茶叶的产量和品质[11-13]。氮是茶树需求量最大的营养元素,缺氮时茶树干物质含量下降,缺磷会影响茶树根茎叶营养元素的含量及其分配[14];缺钾会导致茶树根茎叶重量减少,根冠比增加[15]。研究表明,茶园土壤有机质、有效养分含量降低,会改变茶树体内营养元素的平衡,导致碳含量增高,而氮、钾、镁、硫、铁和锌等矿质营养元素含量降低,继而降低茶叶产量和品质[16]。近年来,茶树相关研究主要集中在茶树土壤有机质、茶树土壤酸化、茶树土壤微生物、茶树土壤质量评价等方面[17-19]。【本研究切入点】目前针对高养分含量不同品种茶树的根际细菌群落结构多样性的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】选择云南省西双版纳茶产区为主的代表性茶园,以不同茶树品种为材料,综合运用植物营养、土壤化学、分子生物学等技术,分析高养分含量不同品种茶树与常规型茶树土壤养分及其细菌群落结构多样性的差异,阐明高养分含量茶树根际土壤细菌群落多样性的形成机制,为茶叶有机种植生产提供科学依据和理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于云南省西双版纳州勐海县云南省农业科学院茶叶研究所试验基地,海拔1160 m,100°27′4.3″ E,21°57′35.6″ N,该区域属于热带、亚热带西南季风气候,茶叶种植土壤为砖红壤,土壤理化性质为有机质48.34 g/kg,全氮1.84 g/kg,全磷0.74 g/kg,全钾5.21 g/kg,水解性氮155.87 mg/kg,有效磷18.39 mg/kg,速效钾101.01 mg/kg。

1.2 供试材料

供试材料为云南省西双版纳州勐海县主栽茶树品种,在勐海基地茶园选择规模较大、种植多年的茶树且种植成片的品种为研究材料,主要茶树品种为云抗10号(MY)、紫娟(MZG)、佛香3号(MF)、大坪大叶茶(MD),均按照当地田间管理进行相同管理。

1.3 试验方法

1.3.1 样品采集及处理 在200 m2茶园内取4种茶树1芽2叶的新梢,每种茶树取100株混合为1个样品,3个重复,干燥后用于测定新梢的氮磷钾含量,同时通过5点取样法,在对应的茶树根际土壤深15 cm处,取1.1 kg土样,每个土样分为2份,其中一份1 kg,用于测定土壤pH、有机质、全氮、全磷、全钾、水解性氮、有效磷、速效钾8个土壤理化指标;另一份0.1 kg,放在-80 ℃冰箱保存,用于测定根际土壤细菌群落多样性。

1.3.2 土壤理化性质测定 按照常规方法进行土壤理化指标检测[20],土壤pH利用玻璃电极法检测,土壤有机质利用硫酸-重铬酸钾容量法检测,土壤全氮利用凯氏定氮法检测,土壤全磷利用钼锑抗比色法检测,土壤全钾利用火焰光度法检测,土壤水解性氮利用碱解扩散法检测,土壤有效磷利用分光光度法检测,土壤速效钾利用火焰光度法检测。

1.3.3 土壤根际细菌群落多样性的16S rDNA高通量分析测定 每个样品称取土样0.5 g,使用Fast DNA SPIN Kit For Soil (MP Biomedicals,LLC)试剂盒提取基因组DNA,并通过1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量,条带清晰、完整的可直接用于后续试验。50 μL PCR反应体系:2 μL模板DNA、2 μL正向引物(10 μmol/L)、2 μL反向引物(10 μmol/L)、4 μL dNTPs (2.5 μmol/L)、5 μL 10×Pyrobest缓冲液、0.3 μL Pyrobest DNA聚合酶和34.7 μL ddH2O。细菌16S的PCR扩增反应引物为16S:F:(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和R:(5′-GG ACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。利用电泳检测PCR产物。

按照基因组DNA文库制备程序,将汇集的DNA产物构建配对末端文库,在Illumina MiSeq平台测序,测序读长为PE250。

1.4 数据统计与分析

对根际土壤细菌多样性原始测序序列进行质控,包括低质量过滤、长度过滤,得到高质量序列进行聚类,划分OTUs/ASVs(后面统一称之为Feature),根据Feature序列组成特征得到其物种分类结果,获得各样品在分类学水平上的群落结构图,并通过Alpha多样性分析,研究样品的Ace、Chao、Shannon及Simpson指数[21]。把不同品种茶树新梢氮磷钾含量、根际土壤理化性质、根际土壤细菌群落作为变量,用软件SPSS 23.0对茶树新梢氮磷钾含量、根际土壤养分、根际土壤细菌群落进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同茶树品种新梢氮磷钾差异分析

由表1可知,不同茶树品种新梢氮含量最高的是大坪大叶茶(MD),为4.13%;最低的是云抗10号(MY),为3.77%,不同茶树品种新梢氮含量差异显著。不同茶树品种新梢磷含量最高的是佛香3号(MF),为0.40%,与其它3个茶树品种达到显著差异,但3个茶树品种间差异不显著。不同茶树品种新梢钾含量最高的是紫娟(MZG),为2.78%;最低的是佛香3号,为1.96%,不同茶树品种新梢钾含量差异显著。

表1 不同茶树品种新梢氮磷钾含量的LSD分析

2.2 不同茶树品种根际土壤养分差异分析

由表2可知,不同茶树品种中,氮含量高的茶树品种MD根际土壤的pH、有机质、全氮、水解性氮含量均较高,分别为5.17、68.50 g/kg、2.83 g/kg、241.33 mg/kg,高于其他茶树品种。磷含量高的品种MF根际土壤的全磷、有效磷含量均较高,分别为1.63 g/kg、115.67 mg/kg,高于其他品种茶树。钾含量高的品种MZG根际土壤的全钾、速效钾含量较高,分别为5.20 g/kg、122.00 mg/kg。

表2 不同茶树品种根际土壤养分的LSD分析

续表2 Continued table 2

2.3 不同茶树品种根际土壤细菌群落多样性

针对不同茶树品种根际土壤样品细菌进行16S rDNA高通量测序,共得到340 391条序列,过滤去除嵌合体后,得到339 219条序列,序列长度以351～474 bp为主,其中氮含量高的茶树品种MD获得的序列最多,为 75 631条;品种MY获得序列最少,为64 975条。

如图1所示,不同茶树品种根际土壤细菌的Shannon指数呈水平状态,说明增加测序量,土壤样本细菌的多样性趋于稳定,能反映茶树根际土壤细菌群落多样性水平。不同茶树品种中,含氮量高的茶树品种MD根际土壤Shannon指数最高,说明其细菌群落多样性水平最高。Simpson 指数分析(图2)表明,氮含量高的茶树品种MD根际土壤的Simpson 指数最低;与Shannon指数相反,Simpson 指数最低代表有高的细菌群落多样性,表明氮含量高的茶树根际土壤具有高的细菌群落多样性。如图3所示,不同茶树品种中,钾含量高的茶树品种MZG根际土壤的Ace与Chao1 指数趋势相同,其Ace及Chao1指数最高,分别为 1141、1168,表明钾含量高的茶树根际土壤具有高细菌群落丰富度。

图1 不同茶树品种根际土壤细菌香农指数Fig.1 Shannon index of bacteria in rhizosphere soil of different tea tree varieties

图2 不同茶树品种根际土壤细菌辛普森指数Fig.2 Simpson index of bacteria in rhizosphere soil of different tea tree varieties

图3 不同茶树品种土壤细菌丰富度比较Fig.3 Comparison of bacteria abundance in rhizosphere soil of different tea tree varieties

2.4 不同茶树品种根际土壤细菌群落结构差异

如图4所示,不同茶树品种根际土壤细菌门水平群落结构基本相同,所有根际土壤主要含变形杆菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、Candidate_division_WPS-2、放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、厚壁菌门(Firmicutes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、蓝藻门(Cyanobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、浮霉菌门(Planctomycetes)等。优势细菌类群有变形杆菌门(占比22.32%～39.95%)、酸杆菌门(占比21.15%～36.68%)、放线菌门(占比13.19%～19.10%)、绿弯菌门(占比0.75%～4.05%)、疣微菌门(占比0.61%～4.10%)、拟杆菌门(占比0.50%～4.82%)、芽单胞菌门(占比0.51%～3.17%)、浮霉菌门(占比0.50%～3.21%)、Candidate_division_WPS-2(占比0.37%～2.03%);厚壁菌门(占比0.53%～1.12%);蓝藻门(占比0.11%～2.17%);以上优势细菌类群占总相对丰度的71.14%～89.53%。不同茶树品种中,氮含量高的茶树品种MD根际土壤中变形杆菌门、放线菌门、疣微菌门、拟杆菌门、芽单胞菌门、浮霉菌门的相对丰度较高。磷含量高的茶树品种MF根际土壤中放线菌门、厚壁菌门、蓝藻门的相对丰度较高。钾含量高的茶树品种MZG根际土壤变形杆菌门、放线菌门、绿弯菌门、浮霉菌门、厚壁菌门的相对丰度较高。

图4 不同茶树品种根际土壤细菌群落(门水平)Fig.4 The bacterial community in rhizosphere soil of different tea tree varieties (at phylum level)

2.5 茶树新梢氮磷钾含量与根际土壤养分的相关性分析

由表3可知,茶树新梢氮含量与根际土壤pH、有机质的相关系数分别为0.706、0.825,呈显著正相关。茶树新梢磷与根际土壤有效磷的相关系数为0.962,呈显著正相关。新梢钾含量与根际土壤全钾、速效钾的相关系数分别为0.965、0.852,均呈显著正相关。

表3 茶树新梢氮磷钾含量与根际土壤养分的相关性分析

2.6 茶树新梢氮磷钾含量与根际土壤细菌群落相关性分析

由表4可知,茶树根际土壤变形杆菌门与新梢钾含量的相关系数为0.798,呈显著正相关。放线菌门与新梢磷含量的相关系数为0.995,呈极显著正相关。绿弯菌门与新梢氮含量的相关系数为0.843,呈显著正相关。浮霉菌门与新梢磷含量的相关系数为0.720,呈显著正相关。厚壁菌门与新梢磷含量的相关系数为0.916,呈显著正相关。蓝藻门与新梢磷含量的相关系数为0.860,呈显著正相关。

表4 茶树新梢氮磷钾含量与根际土壤细菌群落相关性分析

续表4 Continued table 4

2.7 茶树根际土壤养分与根际土壤细菌群落相关性分析

由表5可知,茶树根际土壤变形杆菌门与根际土壤速效钾含量呈显著正相关,相关系数为0.678,放线菌门与根际土壤有效磷呈显著正相关,相关系数为0.616,绿弯菌门与pH、有机质、水解性氮呈显著正相关,相关系数分别为0.707、0.887、0.852,浮霉菌门与根际土壤速效钾含量呈显著正相关,相关系数为0.725,厚壁菌门与根际土壤有效磷含量呈显著正相关,相关系数为0.692,蓝藻门与根际土壤有效磷含量呈显著正相关,相关系数为0.525。

表5 茶树根际土壤养分与细菌群落相关性分析

3 讨 论

茶树生长特性被认为是茶园土壤酸化形成的原因之一[22]。本研究结果表明,不同茶树品种新梢氮磷钾含量达到显著差异。不同茶树品种根际土壤养分含量存在差异,土壤pH、有机质、全钾、有效磷、速效钾是造成茶树养分差异的重要土壤因子,罗凡等[23]研究也表明,不同茶树品种新梢氮磷钾含量差异较大。

根际土壤pH、有机质、水解性氮、有效磷、速效钾含量是对细菌群落结构影响较大的环境因子,不同种类细菌群落结构存在差异。不同茶树品种既有与土壤酸度呈显著正相关的细菌,也有与土壤酸度呈显著负相关的细菌[24]。茶园土壤微生物主要以酸杆菌为主[25]。土壤氮及水解性氮是影响茶园土壤细菌多样性的主要环境因子[26],本研究表明,不同茶树品种根际土壤速效钾含量是影响变形杆菌门相对丰度的因素之一;根际土壤有效磷含量是影响放线菌门相对丰度的因素之一;根际土壤pH、有机质、水解性氮含量是影响绿弯菌门相对丰度的因素之一;根际土壤速效钾含量是影响浮霉菌门相对丰度的因素之一;根际土壤有效磷含量是影响厚壁菌门相对丰度的因素之一;根际土壤有效磷含量是影响蓝藻门相对丰度的因素之一。

细菌群落丰富度、细菌群落多样性是不同茶树品种养分差异形成的重要环境因子。研究表明,不同茶树品种根际土壤细菌、优势菌群以变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门等为主[26],而本研究认为,变形杆菌门、放线菌门、绿弯菌门、浮霉菌门、厚壁菌门、蓝藻门是不同茶树品种养分差异的主要土壤微生物因子。不同茶树品种中,钾含量高的茶树根际土壤具有较高群落丰富度,且其根际土壤中变形杆菌门、浮霉菌门的相对丰度较高,主要是由于具有较高的土壤速效钾含量。说明提高根际土壤速效钾含量,可提高土壤中变形杆菌门、浮霉菌门的相对丰度,从而提高了茶树钾含量。不同茶树品种中,磷含量高的茶树根际土壤中放线菌门、厚壁菌门、蓝藻门的相对丰度较高,主要是由于较高的土壤有效磷含量。说明通过提高根际土壤有效磷含量可提高根际土壤中放线菌门、厚壁菌门、蓝藻门的相对丰度,从而提高茶树磷含量。

不同茶树品种中,氮含量高的茶树根际土壤具有较高的细菌群落多样性,且其根际土壤中绿弯菌门的相对丰度较高,主要是因其具有较高的土壤pH、有机质和水解性氮含量。土壤pH、水解性氮是影响茶园土壤细菌多样性的主要环境因子[24-26],通过根际土壤pH、有机质、水解性氮含量的提高,提高根际土壤中绿弯菌门的相对丰度,从而提高茶树氮含量。pH较高的石灰岩土壤栽培茶树,有利于其新梢的生长发育、促进叶绿素的合成,提高其新梢光合能力[28]。施用有机肥能明显提高土壤有机质含量,减小土壤容重,同时有减缓土壤酸化趋势,明显提升茶园土壤质量[29]。有研究表明,茶树土壤的有机质与水解性氮含量呈极显著正相关[30]。适当增加氮肥的施用能提高根际土壤的细菌、放线菌、真菌数量,增加根际微生物数量,改善根际微生物群落多样性水平[31]。

4 结 论

不同茶树品种新梢氮磷钾含量存在差异,其根际土壤养分含量也存在差异,在不同茶树品种中,新梢氮磷钾含量高的茶树根际土壤pH、有机质、全钾、有效磷、速效钾的含量较高,进而其细菌群落丰富度、细菌群落多样性较大。在不同茶树品种中,高养分含量茶树根际土壤中变形杆菌门、放线菌门、绿弯菌门、浮霉菌门、厚壁菌门、蓝藻门的细菌群落相对丰度较高。