间作柿子树对苹果根际土壤微生物群落结构和功能的影响

郑 娇,刘娟娟,张东华,伍建榕,刘 丽

(西南林业大学生物多样性保护学院/云南省高校森林灾害预警控制重点实验室, 昆明 650224)

【研究意义】苹果(MalusdomesticaBorkh.)属于蔷薇科(Rosaceae)苹果亚科(Maloideae)苹果属(Malus)[1],因其具有丰富的营养价值备受人们喜爱[2]。在中国,苹果是种植面积最广、产量最高、经济地位最重要的水果之一[3]。近年来,苹果连作障碍严重阻碍了苹果产业的发展[4],究其原因主要是因为土壤中毒素残留,土壤营养、酸碱度改变及土壤微生物失衡[5]。植物根际是土壤-根系-微生物三者相互影响、相互作用的主要区域,根际微生物与植物协同发展,被称为是植物的第二基因组[6],能将土壤中植物不可利用的营养元素转化为可利用形式[7],能产生抗生素抑制植物病原菌[8],能产生信号化学物质与根际有益或致病微生物互作,从而间接促进植物生长和抵抗逆境[9-10]。可以说植物病害的发生,尤其是根部病害,与土壤系统中微生物结构及其多样性有着密切的关系[11]。间作能增加土壤微生物的代谢活动,促进微生物多种代谢功能的表达,是最有效的生态农业种植模式之一。【前人研究进展】已有大量研究表明,间作可增加根际微生物的数量,改变根际微生物群落结构[12],从而控制植物病害。如桃树和石榴间作可提高土壤微生物群落的碳代谢能力,从而修复石榴枯萎病害土壤[13];辣椒和紫苏间作能有效防控辣椒疫病的发生,同时提高辣椒的产量和品质[14]。虽然与苹果间作的物种繁杂多样,如大豆[15]、苜蓿[16]、芳香植物[17]等,但针对苹果间作系统的研究主要集中在果实品质及土壤理化性质方面,能有效控制苹果根部病害,解决连作障碍的间作模式尚有待探索。柿子树(DiospyroskakiThunb.)属于柿科(Ebenaceae)柿属(Diospyros),原产于温带地区,在中国栽培历史悠久,果实既可生食也可入药,是药食兼用的经济树种[18]。柿叶中富含较强抗菌活性的多种黄酮类物质[19],已有研究表明,柿子树根际土壤的优势细菌为芽孢杆菌(Bacillus)[20],该属是目前最常见的植物病害生防菌源。柿树与茶间作可以促进茶树的生长和茶业品质的提高[21]。【本研究切入点】有研究发现在苹果园间作柿子树对苹果根腐病具有一定的抑制作用,本文揭示柿子树与苹果树间作对苹果根际微生物群落结构和土壤理化性质的影响。【拟解决的关键问题】以间作(I)和非间作(NI)的苹果根际土壤为材料,采用高通量测序技术,对苹果根际微生物群落结构及土壤理化性质进行分析,以期了解该间作体系的抗病潜力。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

试验地点位于云南省昆明市团结乡鼎顺农业科技有限公司苹果园基地(102°48′ E, 25°11′ N),海拔2195 m,年平均降雨量800～1200 mm,年平均气温13.2 ℃。试验地为平地,土壤类型为红壤。苹果为11年生的德国富士(砧木 M26),柿子树为6年生的次郎,截止采样时已连续间作6年。

1.2 土样采集

2021年6月采集土壤样品,分别选取间作柿子树的苹果根际土和非间作柿子树的苹果根际土2种类型土壤,采集时,清除地表杂物,在距离根际1 cm左右向下挖10～20 cm,取其根际土壤1.1 kg,间作和非间作各随机取3个重复。将所采土样装入洁净自封袋中,标记标签,间作模式苹果根际土样记为I1、I2、I3,非间作模式苹果根际土样记为NI1、NI2、NI3,冰袋低温保存,带回实验室。将每份土样分为两部分,部分土样(1 kg)送往云南同川农业分析测试技术有限公司测定土壤理化性质;另一部分土样(0.1 kg)用于提取土壤总DNA。

1.3 土壤理化性质检测

土壤理化性质由云南同川农业分析测试技术有限公司采用国标规定的方法检测,其中土壤pH采用NY/T 1377—2007电位法测定;土壤有机质采用NY/T 1121.6—2006重铬酸钾容量法测定;全氮采用NY/T 1121.24—2012自动定氮仪法测定;水解性氮采用LY/T 1228—2015碱解扩散法测定;全磷和有效磷采用分别采用NY/T 88—1988和NY/T 1121.7—2014钼锑抗比色法测定;全钾采用NY/T 87—1988火焰光度法或原子吸收分光光度法测定;有效钾采用NY/T 889—2004以中性1 mol/L乙酸铵溶液浸提-火焰光度计测定。

1.4 土壤微生物高通量测序

采用试剂盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit(Omega,USA)提取土壤总DNA。使用Qubit2.0(life,USA)测定DNA浓度,以确保提取足够数量的高质量基因组DNA。

土壤总DNA由生物工程(上海)股份有限公司运用Illumina MiSeq系统进行文库构建、测序等操作。细菌16S rDNA序列扩增引物为341F(5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’)和805R(5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’);真菌ITS序列扩增引物为ITS1F(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和ITS2(5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)。

1.5 数据统计与分析

为获得更加精确和高质量的生物学信息,首先对原始数据的质量进行质控过滤,得到各样本的有效数据,用软件Usearch按照97%相似性对非重复序列 (不含单序列) 进行OTU聚类,在聚类过程中去除嵌合体。16S rDNA基于RDP数据库,ITS基于UNITE数据库进行物种注释。采用软件Mothur计算Shannon指数、Simpson指数、Alpha多样性指数,以Chao1和Ace指数表征丰富度,以Shannon和Simpson指数表征多样性,以Shannoneven指数表征均匀度;Beta多样性是对不同生态系统之间多样性的比较,是物种组成沿环境梯度或者在群落间的变化率,用来表示生物种类对环境异质性的反应。采用R软件mixOmics包进行监督性的PLS-DA分析,pheatmap包进行微生物群落和环境因子相关性分析。采用PICRUSt2分析根际土壤细菌群落功能,用FUNGuild[22]根据营养方式将真菌分为病原营养型、腐生营养型、共生营养型和交叉营养型。利用软件SPSS 26.0进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 苹果根际土壤理化性质

对间作与非间作苹果根际土壤理化性质进行分析。结果(表1)表明,间作柿子树增加了苹果根际土壤中有机质(Organic matter,OM)、水解性氮(Available nitrogen,AN)、全磷(Total phosphorus,TP)含量,降低了土壤中有效钾(Available potassium,AK)含量。

2.2 苹果根际土壤微生物序列及Alpha多样性

通过对间作和非间作苹果根际土壤样品进行Illumina Miseq高通量测序并且质控。结果表明,拼接后共获得细菌有效序列830 755条,测序长度主要分布在400～450 bp;真菌有效序列289 576条,测序长度主要分布在100～500 bp。

从图1可知,随着测序深度的增加,细菌和真菌的微生物稀释曲线逐渐趋于平缓,各样本测序深度均大于0.99,表明取样量充足合理,测序结果已覆盖测试样品中的绝大部分物种,微生物群落结构的置信度较高,此次测序结果可真实反映各处理苹果根际土壤微生物群落结构的组成。

由表2可见,间作和非间作苹果根际土壤细菌丰富度指数和多样性指数均无显著差异(P>0.05)。由表3可见,非间作苹果根际土壤真菌Ace指数显著高于间作(P<0.05),说明间作柿子树显著降低了苹果根际真菌群落的物种数量; Shannon指数显示,间作和非间作苹果根际土壤中细菌和真菌均匀度均无显著差异(P>0.05)。

2.3 苹果根际土壤微生物群落下Beta多样性分析

PLS-DA分析结果表明,间作和非间作苹果根际土壤细菌群落(图2-a)和真菌群落(图2-b)组成均通过横坐标被明显分开,说明间作和非间作的苹果根际土壤细菌群落和真菌群落结构均存在明显差异。

2.4 苹果根际土壤微生物群落组成分析

在门分类水平,从图3-a可知,间作和非间作苹果树根际土壤细菌群落主要分布在9个门,包括变形菌门(Proteobacteria),分别占50.24%、54.15%;放线菌门(Actinobacteria),分别占12.13%、13.52%;酸杆菌门(Acidobacteria),分别占10.25%、11.55%;拟杆菌门(Bacteroidetes),分别占6.07%、3.73%;浮霉菌门(Planctomycetes),分别占3.19%、2.16%;厚壁菌门(Firmicutes),分别占2.46%、2.52%;芽单胞菌门(Gemmatimonadetes),分别占2.22%、2.45%;蓝细菌门(Cyanobacteria),分别占2.11%、0.11%;疣微菌门(Verrucomicrobia),分别占1.24%、1.83%;未鉴定细菌(unclassified_Bacteria),分别占7.23%、5.05%。其中间作显著增加了拟杆菌门在苹果根际土壤的相对丰度(P<0.05),一定程度上增加了蓝细菌门的相对丰度。从图3-b可知,间作和非间作苹果树根际土壤真菌群落主要分布在4个门,包括子囊菌门(Ascomycota),分别占81.36%、56.87%;被孢霉门(Mortierellomycota),分别占11.75%、22.77%;罗兹菌门(Rozellomycota),分别占3.11%、6.49%;担子菌门(Basidiomycota),分别占1.74%、11.17%。间作和非间作苹果根际土壤中占比小于1%及不可归类的真菌门相对丰度分别为2.04%和2.71%,二者无显著差异。

表1 苹果根际土壤理化性质

图1 苹果根际土壤微生物稀释曲线Fig.1 Microbial dilution curve of apple rhizosphere soil

表2 苹果根际土壤中细菌群落多样性指数

表3 苹果根际土壤中真菌群落多样性指数

图2 苹果根际土壤微生物的PLS-DA分析Fig.2 PLS-DA analysis of rhizosphere soil microorganisms of apple

图3 苹果根际土壤微生物群落门水平上的相对丰度Fig.3 Relative abundance of apple rhizosphere soil microbial community at phylum level

在属分类水平,从图4-a可知,间作根际土壤共鉴定出细菌418属,非间作鉴定出436属。其中,丰度前10的属为Gp6,分别占5.01%、2.60%;鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas),分别占3.28%、1.99%;假单胞菌属(Pseudomonas),分别占2.69%、0.38%;芽单胞菌属(Gemmatimonas),分别占2.22%、2.45%;Streptophyta属,分别占2.11%、0.10%;Gp3属,分别占1.35%、2.08%;Lysobacter属,分别占1.34%、0.93%;Ohtaekwangia属,分别占1.34%、0.55%;慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium),分别占0.84%、2.04%;Gp4属,分别占0.75%、1.34%。在间作根际土中共有3个特有属,分别为拟杆菌门、衣原体门和厚壁菌门下的未鉴定属;非间作根际土共有18个特有属,其中变形菌门6个属,放线菌门5个属,厚壁菌门5个属,绿弯菌门2个属。间作和非间作苹果根际土壤中还存在大量未鉴定及不可归类的属,其相对丰度分别为75.88%和79.40%,这表明间作和非间作苹果根际土壤中可能还存在大量新属种。从图4-b可知,间作根际土壤共鉴定真菌251属,非间作鉴定出299属。丰度前10 的属为Phaeoacremonium属,分别占19.97%、8.77%;头梗霉属(Cephaliophora),分别占12.08%、4.60%;被孢霉属(Mortierella),分别占11.54%、22.68%;缘刺盘菌属(Cheilymenia),分别占9.74%、6.30%;毛葡孢属(Botryotrichum),分别占6.78%、2.44%;Arthrographis属,分别占4.09%、0.84%;小镰孢属(Fusariella),分别占3.52%、0.13%;腐质霉属(Humicola),分别占3.26%、2.63%;赤霉菌属(Gibberella),分别占2.30%、3.73%;短梗霉属(Aureobasidium),分别占1.97%、0.32%。在间作根际土壤中有33个特有属,其中子囊菌门20个属,担子菌门8个属,毛霉菌门2个属,壶菌门2个属,捕虫霉门1个属;在非间作根际土壤中共有79个特有属,其中子囊菌门59个属,担子菌门16个属,毛霉菌门3个属,壶菌门1个属。间作和非间作苹果根际土壤中未鉴定及不可归类真菌属的相对丰度分别为19.05%和27.76%。

Other指I和NI根际土相对丰度都<1%及未归类的属。Other refers to the relative abundance of both I and NI rhizosphere soils <1% and unclassified genera.

进一步结合LEfSe分析(图5-a),发现间作与非间作根际土壤细菌共21个属存在显著差异。其中间作显著增加了17个细菌属的丰度,分别为已知属Sporacetigenium、Tepidisphaera、Agromyces、Alkanindiges、Phycisphaera、Pseudoxanthomonas、Terrimonas、Pseudohaliea、Paenisporosarcina共9个;未知属8个,分别隶属变形菌门2属、厚壁菌门2属、浮霉菌门2属、拟杆菌门1属、疣微菌门1属。4个细菌属的丰度显著降低,分别为Sporichthya、Methylocystis、Devosia和Altererythrobacter。从图5-b可知,间作与非间作根际土壤中真菌4个属存在显著差异,间作显著增加了Arthrographis属的相对丰度,降低了Cylindrocarpon、Metacordyceps和Exophiala3个属的相对丰度。

2.5 苹果根际土壤微生物与环境因子间的关系

在属分类水平上,根际细菌与土壤化学性质的Spearman相关性热图(图6-a)所示,间作和非间作根际土壤中Gp6、Sphingomonas和Lysobacter与pH呈显著正相关,与有效钾(AK)呈显著负相关;Pseudomonas与水解性氮(AN)、有效磷(Available phosphorus,AP)、全氮(Total nitrogen,TN)、全磷(TP)呈显著正相关;Bradyrhizobium和Reyranella与AK呈显著正相关;Arthrobacter与有机质(OM)呈显著负相关;Bradyrhizobium和Devosia与pH呈显著负相关; Saccharibacteria_genera_incertae_sedis与全钾(Total potassium,TK)呈显著负相关。

标红部分表示P<0.05显著性水平。The red part indicates P<0.05.

根际土壤真菌与土壤化学性质的Spearman相关性分析(图6-b)表明,在间作和非间作根际土壤中Botryotrichum与pH呈显著正相关;Naganishia与AN、AP呈显著正相关;Readeriella与 pH呈显著负相关;Fusariella、Botryotrichum和Fusarium与AK呈显著负相关;Polyscytalum与AN、AP、TN、TP呈显著负相关;Minimedusa与OM、AN、AP、TN呈显著负相关。

2.6 根际土壤功能预测分析

从图7可知,基于COG数据库将细菌16S rRNA基因序列进行功能预测,共预测出4792个COG,A～W共23种类别。间作和非间作根际土壤中相对丰度最高的是R(一般功能预测),相对丰度最低的是W(真核细胞的细胞外结构功能)。其中,间作显著降低了G(碳水化合物运输和代谢)和W(胞外结构)两大类功能丰度。从表4可知,对丰度达到0.1%的COG进行方差分析,结果表明,间作显著降低了COG1028(不同特异性的脱氢酶)、COG2814(阿拉伯糖流出透性酶)、COG0596(预测水解酶或酰基转移酶)、COG1846 和COG1609(转录调节基因)、COG0491(依赖锌的水解酶)、COG0667(醌还原酶)和COG0604(相关的锌依赖的氧化还原酶)的相对丰度;显著增加了COG0642(信号转导组氨酸激酶)和COG2165(II型分泌通路,PulG蛋白)的相对丰度。

图7 苹果根际土壤微生物COG类别分析Fig.7 COG classification analysis of apple rhizosphere soil microorganisms

表4 苹果根际细菌预测的优势COG功能丰度

FUNGuild真菌功能预测分析表明,共有133个OTU未归类菌群间作(14.73%),非间作(12.37%),其余去除动物病原菌群后,共有344个OTU。间作和非间作根际土壤均以腐生-共生过渡型占主导(45.66%,49.24%),其次为病原-腐生-共生营养型(19.67%,18.75%)、腐生型(13.88%,7.25%)、病原型(2.65%,3.38%)、病原-腐生过渡型(1.83%,4.76%)、共生型(1.46%,3.76%)、病理-共生过渡型(0.11%,0.41%)。进一步方差分析表明,间作与非间作处理的病原-腐生过渡型真菌的丰度差异达显著水平。

3 讨 论

间作能改变土壤养分,本研究表明,间作增加了苹果根际土壤TP含量,根际细菌属Pseudomonas与AP、TP呈显著正相关,根际真菌属Naganishia与AP呈显著正相关;王峰等[23]研究发现Pseudomonas具有抑制病原菌,防治植物土传病害的作用,真菌属Naganishia的部分种有拮抗Fusarium、Phytophtora和Alternaria的活性[24],表明间作有利于调控AP和TP含量,同时促进有益菌的产生。木薯与大豆连续3年间作使土壤中有效氮、有效磷和有效钾的含量增加近20倍[25]。本研究证明,间作柿子树也提高了苹果根际土壤有机质、水解性氮、全磷含量,但也有研究表明,苹果园间作花生显著降低了苹果园有机质和全磷含量[26]。

间作能显著提高土壤微生物群落的多样性和丰富度。本研究结果表明,间作柿子树对苹果根际土壤细菌多样性及丰富度无显著影响,但却显著降低了根际土壤真菌的Ace指数。这可能与柿子树的化感特性有关。

门水平细菌群落结构分析表明,间作与非间作苹果根际细菌均以变形菌门为最优菌门,其次是放线菌门和酸酐菌门,有研究表眀,苹果根腐病[27]、砧木[28]、间作柿子树都不能影响其根际细菌最优门水平的群落结构。与非间作相比,间作柿子树显著增加了苹果根际拟杆菌门的丰度。拟杆菌门细菌是土壤养分转化的重要贡献者[29],因此相对非间作苹果根际土壤,间作苹果根际土壤也能获得更多的养分,同时研究发现在土壤中施加植物根际促生菌也能增加拟杆菌门的相对丰度[30],这也可作为今后调控土壤养分的一种方法。间作与非间作根际均为子囊菌门占绝对优势,其次是被孢霉门,部分植物如半夏、玉米根际真菌符合这个规律[31]。病害土壤中土壤微生物非常敏感[32],其群落多样性和结构变化会影响土传疾病的发生。间作柿子树显著增加了苹果根际细菌属Sporacetigenium、Tepidisphaera、Agromyces、Alkanindiges、Phycisphaera、Pseudoxanthomonas、Terrimonas、Pseudohaliea、Paenisporosarcina;Agromyces属是土壤健康的指标[33];Alkanindiges属是健康生菜的指标[34];苹果根际土中Terrimonas属的丰度与苹果植株的生长呈显著正相关[35];Tepidisphaera属细菌多具有降解胞外生物聚合物的潜力[36]。此外,Agromyces对间作大豆[37],Pseudoxanthomonas对植物[38]的生长有促进作用。间作增加了真菌属Arthrographis的相对丰度。有研究表明真菌Arthrographis对腐殖质的形成有重要作用,而堆肥腐殖质可改良土壤,降低病原微生物的产生几率[39-40]。可见,间作柿子树显著增加了一些对苹果植株健康生长有益的细菌和真菌丰度。

土壤中植物病原真菌增加是苹果连作障碍的重要原因之一,其中Fusarium、Cylindrocarpon和Rhizoctonia等病原出现的频率较高[41]。本研究中间作柿子树显著降低了苹果根际真菌属Metacordyceps、Cylindrocarpon、Exophiala的相对丰度。这与Jia等[42]研究发现芥菜与黄瓜间作显著降低Metacordyceps属相对丰度的研究结果一致,这可能与芥菜和柿子树都是多酚化合物含量较高的植物有关。Cylindrocarpon属丰度降低,暗示着间作柿子树对抵御苹果连作障碍有一定潜力。Exophiala属下真菌多数引起人类和动物的疾病[43]。

本研究通过PICRUSt2功能预测分析,发现间作显著降低了碳水化合物运输和代谢与胞外结构两大类功能的相对丰度。这与董奇琦等[44]研究发现玉米、花生间作后土壤细菌碳水化合物的运输和代谢相对丰度升高的研究结果不一致,这可能与根系环境,土壤肥力、气候条件等差异和间作体系不同有关。间作显著增加了COG0642(信号转导组氨酸激酶)和COG2165(II型分泌通路,PulG蛋白)的相对丰度。信号转导组氨酸激酶是细菌双组分系统的一部分,是细菌中主要的信号转导途径。该功能的增强反应了间作系统下根际细菌对环境变化的响应。细菌II型分泌系统主要是分泌与疾病直接相关的效应子,而该系统中PulG蛋白的过渡产生会极大降低分泌素的细胞水平,从而阻碍分泌[45]。采用FUNGuild对间作和非间作根际土壤真菌进行功预测,结果表明,间作显著降低了病原-腐生过渡型真菌的丰度,但目前造成苹果根腐的常见病原菌Fusarium、Cylindrocarpon、Rhizoctonia都属于腐生型病原菌。

4 结 论

对间作和非间作苹果根际土壤微生物群落结构分析结果表明,间作柿子树增加了苹果根际土壤有机质、水解性氮、全磷含量,有助于提高苹果根际土壤肥力。间作和非间作土壤细菌和真菌群落结构都存在显著差异,间作显著增加了苹果根际土壤中17个细菌属和1个真菌属的丰度;显著降低了4个细菌属和3个真菌属的丰度,其中包含Agromyces、Alkanindiges、Tepidisphaera、Pseudoxanthomonas等有益微生物相对丰度的显著增加及苹果根际主要病原真菌Cylindrocarpon丰度的减少,在一定程度上为控制苹果根部病害提供了良好的根际环境。