外源磷调节下铜对波斯菊种子萌发和幼苗生长的影响

郭晓蕾，王友保

（1.安徽师范大学 生态与环境学院，安徽 芜湖 241002；2.厦门大学 环境与生态学院，福建 厦门 361102）

随着采矿和冶金等行业的快速发展，土壤重金属污染状况日益严重[1]。例如，铜矿区矿业活动会造成重金属铜进入周边水体和土壤，破坏土壤结构与营养，破坏生物生存环境，进而危害人类健康[2]。研究表明，植物体内过量的铜会危害植物种子萌发与幼苗生长，其中植物根系与土壤接触最为密切，会最先受到铜毒害，进而使植物的生长发育受到影响[3]。适当增加植物生长环境的磷含量可以加速植物生长并提高产量，因为磷可促进根系快速生长，并使植物更早地获得生长所需的资源[4]。过量施用磷肥反而会造成植物损伤[5]，适当施加磷肥才会对植物生长发育有益，尤其是可以促进植物根系发育和提高植物的抗逆性[6-7]。

波斯菊（Cosmos bipinnatusCav.）别名秋英、大波斯菊，为菊科秋英属一年生或多年生草本花卉，喜光，可以耐受贫瘠的土壤，生命力旺盛。作为一种常见的观赏花卉，波斯菊已广泛应用于城市园林绿化中。研究证实，波斯菊能够在一定程度的重金属胁迫下生存[8]，而添加适宜浓度的外源磷可有效缓解植物受重金属胁迫所导致的生长发育不良症状[9]。基于此，本文研究了不同浓度的磷对铜胁迫下波斯菊种子萌发与幼苗生长的影响，以期揭示波斯菊的铜胁迫响应机制，并为更好地利用其修复重金属污染土壤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试波斯菊种子购自于山东济南匠人花海；实验所用的磷为KH2PO4，铜为分析纯CuSO4·5H2O。

1.2 实验方法

选取饱满无残缺的波斯菊种子，先用10%次氯酸钠溶液消毒10 min，然后用蒸馏水反复冲洗干净，最后用滤纸吸干种子表面水分备用。将消毒后的种子均匀地放于铺有双层滤纸的培养皿内，每皿30粒。参照陈天等的方法[9]，设置3个KH2PO4水平（0、2和20 mg/L，以P浓度计算），并以霍格兰营养液配置Cu-SO4浓度梯度溶液（0、10、50、100、200、250 mg/L，以Cu2+浓度计算），共18个处理，分别对各组种子添加不同浓度的溶液，每个处理设置3个平行。于25°C智能光照培养箱内培养，每天补充适量相应浓度的重金属溶液，使滤纸和种子保持湿润状态，且滤纸周围不出现任何水膜。若种子出现发霉则及时移出，必要时则更换培养皿和滤纸。

1.3 测定项目

实验周期共12 d。从第3 d 开始，连续每天记录种子发芽数（标准为波斯菊种子的芽长等于种子长度的1/2），并计算发芽势和相对发芽势；在第12 d 计算发芽率和相对发芽率，并测定幼苗株高和主根长，同时观察幼苗的外伤症状，并测定幼苗叶片的丙二醛（MDA）含量。在观察植物生长状况时，采用目测估计法，将植株生长状况分为4个等级：正常生长（无伤害），目测不到伤害症状；轻度伤害：仅中心部位失绿（以明显浅于正常生长叶片的绿色作为失绿的判断依据，下同）；中度伤害：叶片中心部位及外围出现不同程度失绿；重度伤害：植株矮小，叶片失绿[10]。叶片MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法[11]。

1.4 指标统计及计算

在观察种子萌发状况时，统计指标主要有发芽数、发芽势、发芽率、相对发芽势和相对发芽率，测定方法包括[11]：发芽势（%）为3 d内籽粒萌发数与相应籽粒总数之比再乘以100；相对发芽势（%）为重金属处理组发芽势与对照组发芽势之比再乘以100；发芽率（%）为萌发数与籽粒总数之比再乘以100；相对发芽率（%）为重金属处理组萌发率与对照组萌发率之比再乘以100。使用SPSS17.0软件进行统计分析，并使用Excel 2007进行数据处理和绘图。

2 结果与分析

2.1 外源磷对铜胁迫下波斯菊种子萌发及幼苗生长指标的影响

由表1可知，随着Cu2+浓度的增加，波斯菊种子的发芽势和相对发芽势先增加后减少。在Cu2+浓度为50 mg/L和100 mg/L时，发芽势处于较高值；当Cu2+浓度到达200 mg/L及以上时，发芽势和相对发芽势较对照组明显降低。随着外源磷浓度升高，相同Cu2+浓度下的种子发芽势和相对发芽势基本呈现先升高后降低的趋势，但当Cu2+浓度在50 mg/L和100 mg/L时，随外源磷输入浓度增高，种子发芽势和相对发芽势也越高。

表1 外源磷对铜胁迫下波斯菊种子萌发及幼苗生长指标的影响

随着Cu2+浓度增加，波斯菊种子的发芽率和相对发芽率先增加后减少。在Cu2+浓度为100 mg/L时，发芽势到达最高值；当Cu2+浓度到达250 mg/L时，发芽势和相对发芽势最低，且与对照组相比明显降低。同时，随着外源磷浓度的提高，种子的发芽率和相对发芽率大致呈不断降低的趋势。在高浓度磷和铜处理的培养皿里，部分已萌发的种子叶片发褐、扭曲甚至死亡，意味着高浓度外源磷和铜处理对种子的初期萌发是有益的，但随着时间推移，种子受到的伤害逐渐累积，最终导致其死亡。当Cu2+浓度较低（0 mg/L和10 mg/L）时，波斯菊幼苗的株高和根长较大，随Cu2+浓度增加，幼苗株高和根长呈降低趋势，当Cu2+浓度高于200 mg/L时，幼苗株高和根长与对照组相比明显降低。当磷浓度为2 mg/L时，幼苗株高和根长比未施加外源磷下铜胁迫的各组幼苗略有增高，而高浓度磷（20 mg/L）则较未施加外源磷处理的降低。

2.2 外源磷对铜胁迫下波斯菊幼苗外伤的影响

波斯菊幼苗的外伤症状与培养液中Cu2+浓度直接相关。当Cu2+浓度不超过50 mg/L时，各组幼苗未出现明显的外伤症状，且多株幼苗已长出心叶，生长状况良好。当Cu2+浓度达到100 mg/L时，幼苗开始出现轻度外伤症状，有叶片中心失绿的现象。当Cu2+浓度到达200 mg/L时，幼苗伤害严重，开始出现明显的中度伤害症状，且幼苗叶片的中心和外围有不同程度的失绿，部分叶片开始出现红褐色的斑点，植株也比较矮小。当Cu2+浓度达到250 mg/L时，幼苗出现重度伤害症状，叶片多处有红褐色斑点，而且有的幼苗严重失绿，叶片呈黄褐色，植株矮小。与此同时，在高的外源磷浓度（20 mg/L）下，波斯菊受铜胁迫所造成的外伤症状也更加严重。

2.3 外源磷对铜胁迫下波斯菊幼苗丙二醛含量的影响

随着Cu2+浓度增加，波斯菊幼苗叶片MDA含量不断升高（图1）。当外源磷浓度相同，而Cu2+浓度为0、10、50 mg/L 时，叶片MDA 含量无显著差异；当Cu2+浓度达到100 mg/L及以上时，叶片MDA含量随Cu2+浓度上升而明显上升。同时，随着外源磷浓度的升高，叶片MDA含量呈现先降低后升高的趋势。当磷浓度为2 mg/L时，铜胁迫下各组叶片MDA含量均较另外两组磷调节下叶片MDA含量低。

2.4 种子萌发和幼苗生长的最适磷浓度

将外源磷浓度和各组铜胁迫下波斯菊的发芽势、根长和叶片MDA含量进行回归分析，并计算铜胁迫下对种子萌发和幼苗生长促进效果最好的磷浓度平均值。由表2和表3可知，外源磷浓度在6.37 mg/L和9.08 mg/L 时对波斯菊发芽势和根长的促进效果最好。由表4 可计算铜胁迫下各组最佳磷浓度平均值，当外源磷为10.65 mg/L时，叶片MDA含量最低，意味着外源磷缓解铜胁迫对幼苗危害的效果最好。综合来看，在Cu2+浓度低于50 mg/L时，9.78 mg/L外源磷输入对波斯菊的生长最为适宜；在Cu2+浓度高于100 mg/L时，5.25 mg/L外源磷对波斯菊的生长最佳。

表2 外源磷对铜胁迫下波斯菊种子发芽势的回归分析

表3 外源磷对铜胁迫下波斯菊幼苗根长的回归分析

表4 外源磷对铜胁迫下波斯菊幼苗丙二醛含量的回归分析

3 讨论

土壤本身就含有一定量的重金属元素，其中的铜元素是植物生长所必需的微量营养元素之一。土壤铜污染主要来自铜矿山和冶炼废水[12-13]，只有当土壤累积的重金属浓度超过植物需求，甚至超出其耐受极限，植物才会表现出受损伤的症状。研究重金属胁迫下种子发芽及幼苗生长情况，观察其能否在实验模拟环境中顺利生长，有利于判断植物能否在环境胁迫下繁殖扩散，可以为重金属污染土壤的植物修复与治理提供理论参考和技术支撑[14]。

在单一铜胁迫下，随着Cu2+浓度升高，波斯菊种子的发芽势、相对发芽势、发芽率、相对发芽率、株高和根长均呈现先上升后下降的趋势，说明低浓度的铜不仅不会对植物生长造成损伤，而且有利于其发芽和生长[15]。当Cu2+浓度低于100 mg/L 时，其对波斯菊种子的发芽势和发芽率有促进作用，说明在萌发期，适当的铜添加有利于提高种子的发芽率[16]。与此同时，10 mg/L的Cu2+浓度可以促进波斯菊幼苗的长高和生根，而100 mg/L的Cu2+浓度则对幼苗株高和根长有显著抑制作用，且这种抑制作用在根长方面比株高更明显。出现此现象的原因可能是由于根直接接触铜溶液，铜毒害更容易作用于根部细胞，从而影响了根细胞的生长发育[17]。植物受重金属胁迫的最直接体现就是其外伤症状，可以通过幼苗长势、叶片颜色和形态来初步判断其是否受到胁迫。当Cu2+浓度超过100 mg/L时，可以明显观察到波斯菊幼苗的受害情况，其逐渐表现为中度伤害和重度伤害，叶片有不同程度的失绿和红褐色斑点，同时植株矮小且卷曲在一起，有根尖坏死现象。此外，在逆境胁迫下植物往往会发生膜脂过氧化作用，其中MDA是膜脂过氧化的最后产物，当其积累到一定量时就会对生物膜造成伤害[18]。因此，MDA是反映植物体抗氧化能力的重要参数，测量波斯菊幼苗MDA含量可以作为考察细胞受胁迫程度的指标之一。当Cu2+浓度较低时，波斯菊幼苗MDA含量变化不明显，但是当Cu2+浓度超过100 mg/L时，MDA含量就明显上升，说明了高浓度的Cu2+浓度胁迫会使幼苗发生膜脂过氧化以致于引起膜损伤。

此外，磷是植物生长过程所需的一种重要营养元素，也是影响植物生长和产量的主要因素之一，多施磷肥可以促进作物生长[19]。由实验结果可知，低浓度的外源磷输入对波斯菊的发芽势、相对发芽势、株高和根长等指标有促进作用，能降低幼苗MDA含量，减轻幼苗膜脂过氧化伤害。研究表明，添加磷酸盐会缓解植物所受到的重金属胁迫[20]，因此低浓度的外源磷输入可能会改善铜污染区域的植物生长，减轻高浓度铜胁迫所引起的损伤。但是，随着外源磷浓度的增加，植物受毒害的现象非但没有减轻反而加剧了。本文研究发现，20 mg/L 磷浓度下波斯菊的发芽率和相对发芽率明显降低，外伤症状加剧，且MDA含量也明显升高，意味着在高磷水平下输入铜，波斯菊将受到更严重的胁迫。在施加外源磷肥时，应先考虑土壤受铜污染的程度，以及对植物发芽势和发芽率最有益的浓度。在低铜或无铜环境中，9.78 mg/L外源磷对波斯菊的生长最有益；在铜胁迫严重的环境中，5.25 mg/L外源磷则有利于波斯菊生长。在植物生命周期中，种子发芽和幼苗生长是关键阶段，可能受到多种因素的胁迫，当环境中铜浓度较低时，波斯菊可以忍受较高磷浓度，较高磷浓度更能促进其生长，但是当其处于高铜胁迫下，可能较低磷浓度才有利于调节其生长，而过高磷浓度反而会和铜协同对种子萌发和幼苗生长造成更严重的伤害。因此，在添加外源磷肥来缓解生长在铜污染土壤的受害植物症状时，应该通过实验来谨慎确定外源磷的含量。