患者外周血细胞分析和结核抗体检测在诊断肺结核中的临床价值

刘振宁 许蕴怡 胡丽环 刘志辉 胡锦兴 李华 关平

广州市胸科医院检验科（广州 510095）

目前病原学检测方法对结核诊断效率不高：涂片简单、快速，但检出率低、不能区分死菌活菌、不能排除非结核分枝杆菌；培养作为诊断的金标准，检出率略高于涂片，但耗时长；分子检测快速，方法学也逐渐趋向简便，但检出率与培养相当而仍不理想；其总检出率均不足60%［1-2］。因此研究人员一直在探讨检出率更高、操作更简便的实验诊断方法。具备快速、经济、简便的抗体检测成为了其中一个选择。现阶段虽然结核抗体的检测性能不佳，容易导致误诊漏诊［3-4］，但抗体检测具备的优点，尤其在新冠传染病的诊断中取得的巨大成功［5］，使得人们在结核病诊断一直没有放弃这方面的努力［6］。我们在蛋白芯片的检测过程中发现调整临界值可改善诊断性能，因而进行抗体检测研究。由于当前抗体检测性能尚有不足，且结核病的发生发展主要与细胞免疫相关［7-8］，有研究指出我们的检测指标对结核病诊断具有较好的意义［9］，因此本项目从细胞免疫的角度出发，对CD45+CD3+淋巴细胞、CD45+CD64+单核细胞、CD161+细胞以及RF 进行分析。报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料根据《中华人民共和国卫生行业标准-肺结核诊断（WS 288-2017）》，选取本院2021年初次收治且未抗结核治疗的肺结核患者202 例作为结核病组，男119 例，女83 例，年龄18～65 周岁，无合并其他感染性疾病、恶性肿瘤和免疫性疾病。全部患者均经过痰涂片、痰培养确诊，或临床诊断为肺结核。另外，选取同期本院的体检健康者120 例作为健康对照组。男72 例，女48 例，年龄20～65 周岁，均经过临床诊断，排除了结核病。

1.2 仪器与试剂LE-01-B 型生物芯片阅读仪购于西安联尔科技有限公司；5810R 高速冷冻离心机购于德国eppendorf 公司；BD-Accuri-C6 流式细胞仪购于美国BD 公司；结核蛋白芯片检测系统试剂盒购于西安联尔科技有限公司；CD161 检测试剂购于深圳联合医学科技有限公司。

1.3 方法结核五项检测流程如下。提取血清，采用结核蛋白芯片检测系统试剂盒，取出芯片，滴加4 滴三羟甲基氨基甲烷缓冲液，完全渗入后加待检血清100 μL，血清渗入后加6 滴三羟甲基氨基甲烷缓冲液，渗入后滴加6 滴胶体金标记的羊抗人IgG，最后加入6 滴三羟甲基氨基甲烷缓冲液，通过LE-01-B 型生物芯片阅读仪进行检测，仪器软件自动判读结果。

流式细胞检测流程如下。采集新鲜的抗凝全血，转移100 μL 至流式管，加入12 μL 混合抗体（CD3、CD45、CD64 和CD161 抗体），震荡混匀后在室温下避光孵育20 min。在上述流式管加入红细胞裂解液2 mL，震荡混匀后在室温下避光孵育5 min，2 000 r/min 离心5 min，除去上清液后加入磷酸盐缓冲液（PBS）2 mL，震荡混匀后2 000 r/min离心5 min，倒掉上清液，加入200 μL PBS，震荡混匀后用流式细胞仪进行检测。用软件FlowJo 分析流式结果，分别筛选出淋巴细胞（CD45+CD3+）、单核细胞（CD45+CD64+）、CD161+细胞，计算淋巴细胞比例（CD45+CD3+%）、单核细胞比例（CD45+CD64+%）和CD161+细胞比例（CD161+%），最后利用TensorFlow 的Keras 库构建深度学习网络分类模型［9］计算结核菌感染风险指数RF。RF 值=淋巴细胞百分比/单核细胞百分比×淋巴细胞百分比。

1.4 统计学方法采用SPSS 20.0 统计软件进行分析。以最小值和最大值描述数据的离散程度，四分位数描述数据的集中趋势。如果符合正态分布的计量资料以表示，组间比较采用t检验；偏态分布计量资料秩和检验，统计量的比较采用t检验。通过受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线的曲线下面积（area under the curve，AUC）分析各项检测指标诊断结核病的临床价值。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组间各抗体、细胞比例及其感染风险指数的比较由于各检测项目含有非正态分布数据，本研究采用秩和检验进行分析。计算结核组和健康组的最小值、最大值及其四分位数。两组间的38KD、CFP10、ESAT-6 比较差异无统计学意义（P＞0.05），16KD、LAM、CD45+CD3+%、CD45+CD64+%、CD161+%、RF 的差异有统计学意义（P均为0）。见表1。

表1 两组间5 种抗体、3 种细胞比例及其感染风险指数的比较Tab.1 Comparison of five antibodies, three cell ratios and infection risk index between the two groups

2.2 各检测项目的ROC 曲线结果绘制ROC 曲线，计算各检测项目的AUC，各检测项目ROC 曲线下面积分别为RF：0.884；CD45+CD3+%：0.860；CD45+CD64+%：0.834；16KD：0.748；LAM：0.680；CD161+%：0.667；CFP10：0.564；ESAT-6：0.535；38KD：0.525。见图1。

图1 5 种抗体、3 种细胞比例及其统计风险指数诊断结核的ROC 曲线Fig.1 ROC curve of 5 kinds of antibodies，3 kinds of cell ratio and statistical risk index in diagnosis of tuberculosis

2.3 各检测项目最佳临界值下的诊断性能指标数据通过ROC 曲线得出16KD、38KD、CFP10、ESAT-6、LAM、CD45+CD3+% 、CD45+CD64+% 、CD161+%、RF 的最佳临界值分别为1.031、1.074、1.075、1.062、1.161、78.480、14.250、34.765、0.469。各检测项目在最佳临界值下的诊断性能指标见表2。

3 讨论

结核病是由结核分枝杆菌引起的以呼吸系统感染为主的慢性传染性疾病，是2019年之前导致人类死亡最多最古老的传染病之一［10-12］。尽管相关研究已经进行了差不多一个世纪，取得了进展，但尚未明确用于诊断和监测疾病进展过程中，重复性较好、易于量化的检测指标［13］。而目前结核抗体的诊断价值不大，易导致误诊漏诊，细胞免疫方面的检测还未有明确结论。本项目显示，结核抗体中，最佳临界值下16KD 的临床诊断价值最高，细胞免疫相关指标中RF、CD45+CD3+%、CD45+CD64+%在肺结核临床诊断中具有较高的临床应用价值。通过本研究结果，在结核病诊断中，可以先用快速、经济、简便的结核抗体16KD 进行快速筛查，再用RF、CD45+CD3+%、CD45+CD64+%三个指标弥补16KD 的缺陷。

有研究表明，主要以LAM、38KD 及16KD 三项联合定性检测初治结核病患者血清抗体的蛋白芯片技术敏感度为66.2%～69.2%［14-15］，而16KD、38KD、CFP-10、ESAT-6 和LAM 五项联合的定性检测抗体的敏感度为71.2%［16］。上述结果与我们目前在临床实际应用的情况相符。然而，在我们尝试定量检测分析结核抗体得出最佳临界值后，结核五项各指标的临床诊断价值均得到提升，其中16KD 的临床诊断价值为五项最高，AUC 为0.748，最佳临界值为1.031，灵敏度（82.18%）高于多项联合的定性检测（表2）。早期、快速、准确的诊断对于控制结核病流行具有显著效果［17］，所以不应放弃研究取样方便、操作简单快速的结核抗体检测。我们的研究成果表明定量检测可以显著提升结核抗体的临床诊断价值，最佳临界值的单项16KD 定量检测足以替代多项联合的定性检测，为临床提供更高的诊断价值，更便捷、更快速、更经济的检测方案。

表2 各检测项目诊断性试验评价指标分析Tab.2 Analysis of diagnostic test evaluation index of each test item

CD161 是一种C 型凝集素样受体，CD161+细胞是人类记忆Th17 细胞的标志，是表现炎症活性的细胞亚群，有结果表明，在结核菌刺激下，CD161+亚群的百分率下降［18-19］。相关研究报道，包括CD36、CD38、CD44、CD263、CD55、CD33、CD18 和CD161在内的大分子里，CD161 是区分结核患者的最佳标志物，CD161+T 细胞的百分比明显低于健康对照组，感染风险指数RF 的灵敏度和特异度在72%左右［20］。另有研究发现结核患者CD45+单个核细胞数表达较高，有助于结核病的诊断［21］。单核细胞属于先天免疫系统，CD64+单核细胞在结核患者中的表达显著升高，敏感度为76.6%，特异度为73.3%，在对抗结核杆菌方面发挥着关键作用［22］。有学者研究指出，结核患者CD3+淋巴细胞的百分比显著低于健康对照组［20］。结核患者免疫功能的不同易导致结核抗体的阶段特异性，患者体内免疫细胞相关指标可随着疾病的发展而发生变化［23-24］。在此背景，我们选择了CD45+CD3+淋巴细胞、CD45+CD64+单核细胞、CD161+细胞以及RF 作为检测结核病的相关指标。上述研究结果的细胞表达趋势基本与我们的研究结果相符合。CD45+CD3+%、CD45+CD64+%和RF 的AUC 均大于0.83，临床诊断价值较高（图1）。其中由CD45+CD3+淋巴细胞、CD45+CD64+单核细胞、CD161+细胞建立的结核菌感染风险指数RF 临床诊断价值最高，最佳临界值0.469，灵敏度75.74%略高于相关报道的72%，特异度92.50%则显著高于72%，其余诊断评价指标均较高（表2）。我们的结果表明，结核抗体16KD可与CD45+CD3+%、CD45+CD64+%、RF 结合使用，优势互补。

免疫学检测是病原学检测的有力补充，病原学检测用于结核病的鉴别诊断，确保不出错，免疫学检测用于结核病的初筛，尽量不漏诊，二者可联合检测，综合判读，弥补不足。本实验通过ROC 曲线得出各指标的最佳临界值，筛选出在结核病诊断中具有重要临床价值的指标，为临床提供了一种新颖、便捷、快速、经济的诊断解决方案，解决当前结核病诊断的局限性，为进一步的大样本研究提供基础。但本研究仍存在不足，如未分析其他肺部疾病与上述指标的关系，样本量未足够大，代表性未足够强，还需继续对16KD 与免疫细胞的临床价值深入研究。

【Author contribution】LIU Zhenning：Conceptualization，Methodology，Writing-Original Draft. XU Yunyi：Writing-Review & Editing，Resources. HU Lihuan：Investigation，Validation. LIU Zhihui：Data Curation，Supervision. HU Jinxing：Project Administration. LI Hua：Software，Validation. GUANG Ping：Resources，Supervision.