不同发酵剂对泡萝卜挥发性风味成分及感官品质的影响

杨洋，杨宇航，王洪伟，索化夷，宇嘉，张玉*

1(西南大学 食品科学学院，重庆，400700)2(西南大学，食品科学与工程国家实验教学示范中心，重庆，400700)

我国(盐渍)泡菜的历史早于《诗歌》，应起源于3 000多年以前的商周时期[1]。泡菜主要以新鲜蔬菜或蔬菜咸坯为原料，添加或不添加辅料，经中低质量分数(2%～10%)食盐水泡渍发酵调味(或不调味)、包装(或不包装)、灭菌(或不灭菌)等生产加工而成的蔬菜制品[2]。泡菜发酵过程中，不同微生物之间复杂的相互作用将原料中的碳水化合物、脂肪和蛋白质等大分子物质降解成更容易吸收的小分子活性物质，从而提高营养利用率[3]。泡菜中含有大量的维生素、矿物质、膳食纤维和其他功能成分，可以满足人体的营养需求，同时也具有调节肠道菌群、降低血清胆固醇、抗氧化、减肥等保健作用，延长了保质期，深受消费者喜爱[4]。目前，国内的工业化泡菜生产企业已颇具规模，其中仅四川建设泡菜原料基地就有1 467 km2以上，带动基地农民增收近30亿元[5]。2020年1月～10月，四川省东坡区130户规模以上工业企业累计完成产值281.5亿元，同比增长2.4%，其中10月份当月完成产值31.25亿元，同比增幅达5.89%，工业经济持续平稳增长[6]。

目前国内制作泡菜多采用自然发酵工艺，其原理是在高浓度食盐溶液中，利用食盐的高渗透压抑制有害微生物的生长，而附着在蔬菜表面的乳酸菌不断增长成为主导菌发酵产酸获得泡菜[7]。市场上对泡菜发酵剂的需求越来越高，利用发酵剂可以缩短发酵周期，获得较为稳定的质量。泡菜中的优势菌种在发酵过程中发挥了主导作用，利用优势菌种作为发酵剂制备风味优良的泡菜，是满足当前市场需求的趋势所在[8]。经骐源等[9]探究了不同发酵剂对泡萝卜品质的影响，研究发现发酵过程中泡萝卜所含氨基酸、有机酸种类丰富，给予泡萝卜良好的风味品质。云琳[10]根据在萝卜汁中的产酸特性和生长特性，从肠膜明串珠菌、植物乳杆菌和耐乙醇片球菌3种乳酸菌(共30株)中筛选出10株，并进行复配发酵，研究表明不同菌株复配可以调节泡菜中代谢产物的含量，使泡菜中的糖类物质和有机酸类物质保持在适当水平，挥发性风味物质的种类与含量也相对较高，可以赋予泡菜良好的风味。朱海霞[11]研究了辣椒泡菜的发酵工艺，并制备了高活性的泡菜专用发酵剂，在最佳发酵条件下发酵的辣椒泡菜具有发酵周期短，产品品质稳定，亚硝酸含量远低于国家标准等特点。

直投式发酵剂是一种高度浓缩和标准化的冷冻干燥发酵剂，经过液体培养基增殖培养、菌体浓缩、添加保护剂，最后经真空冷冻干燥等工序制成，具有体积微小、活力较强、活菌含量高等特点[12]。发酵剂的质量对于泡菜品质具有至关重要的作用，而目前我国对泡菜发酵剂的相关研究较少。因此，想要提高我国泡菜行业的发展，制备优良的发酵剂是关键。有研究[13]筛选了6种风味优质的泡菜卤水对泡菜发酵过程进行系统研究，对泡菜成熟(发酵7 d)样品的细菌和真菌多样性进行系统分析。本研究通过对不同发酵剂发酵的泡萝卜的挥发性成分进行定性和半定量分析，利用聚类分析法探究挥发性成分与菌种相关性，利用闪现剖面(flash profile,FP)法比较泡萝卜的品质差异。旨在为得到较好的直投式复合发酵剂，为后续高品质商品化泡萝卜发酵剂筛选提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜的白萝卜、泡菜盐，购自重庆市北碚区永辉超市。

MRS培养基，广东环凯微生物科技有限公司。

6种不同微生物群落组成的泡菜原液来自重庆地区家庭制作(分别为标记为发酵剂HS、L、S、W、ZB、ZFK，涉及的百分比均为所占细菌或者真菌的相对丰度)[9]。

发酵剂HS：主要细菌为植物乳杆菌(61.57%)和食窦魏斯氏菌(14.18%)；主要真菌为副银念珠菌(10.14%)和其他(21.45%)。菌落总数为2.91×107CFU/mL，pH 2.55，盐度为3.0%。

发酵剂L：主要细菌为植物乳杆菌(56.50%)、布氏乳杆菌(26.40%)和耐乙醇片球菌(15.65%)；主要真菌为毛榛毕赤酵母(99.84%)。菌落总数为5.45×106CFU/mL，pH 3.95，盐度为3.0%。

发酵剂S：主要细菌为布氏乳杆菌(66.26%)、未分类的乳杆菌(12.58%)；主要真菌为毛榛毕赤酵母(99.93%)。菌落总数为1.04×106CFU/mL，pH 3.98，盐度为5.5%。

发酵剂W：主要细菌为布氏乳杆菌(68.65%)和植物乳杆菌(28.64%)；主要真菌为毛榛毕赤酵母(99.99%)。菌落总数为7.35×106CFU/mL，pH 5.07，盐度为3.0%。

发酵剂ZB：主要细菌为植物乳杆菌(43.63%)、布氏乳杆菌(39.87%)和耐酸乳杆菌(12.34%)；主要真菌为Issatchenklaorientalis(85.52%)。菌落总数为9.92×106CFU/mL，pH 2.54，盐度为6.5%。

发酵剂ZFK：主要细菌为植物乳杆菌(30.79%)、布氏乳杆菌(14.81%)和未分类的乳杆菌(20.90%)；主要真菌为毛榛毕赤酵母(100.00%)。菌落总数为1.55×107CFU/mL，pH 3.99，盐度为5.0%。

1.2 仪器与设备

GCMS-QP2010 GC-MS联用仪，日本岛津仪器公司；RTX-WAX色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，美国安捷伦公司；15 mL顶空进样瓶、固相微萃取(solid phase microextraction，SPME)装置、50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头，美国Supelco公司。

1.3 实验方法

1.3.1 发酵泡萝卜制备

泡萝卜的制备参考王艳等[2]方法,制备工艺如下:

新鲜萝卜→清洗→晾干→切分→称重→加入6%(质量分数)盐水[m(萝卜)∶m(盐水)=1∶1，萝卜质量2 500 g]→接种不同发酵剂(菌落数108CFU/mL，W接种100 mL，L接种50 mL，ZFK接种25 mL，HS接种80 mL，S接种40 mL，ZB接种15 mL)→发酵(25 ℃)

1.3.2 泡萝卜挥发性香气成分检测

挥发性香气成分的提取和检测条件参照汪冬冬等[14]的方法略作修改。称取5 g泡萝卜[含水量(83±2)%]制成匀浆，准确称取5 g于15 mL顶空进样瓶中，加1 g NaCl和10 μL的庚酸甲酯(640 μg/L)混匀、密封。于45 ℃条件下平衡30 min后，将萃取头插入进样瓶中萃取30 min，然后取出萃取头插入GC-MS进样口解吸5 min。

GC条件：色谱柱柱型：RTX-WAX色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升温程序：初始温度为40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min速率升至150 ℃，保持3 min，再以10 ℃/min速率升至230 ℃，保持2 min；载气为氦气，流速为0.8 mL/min，不分流进样。MS条件：电离方式为电子电离，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，接口温度250 ℃，能量70 eV；质量扫描范围25～450m/z。

定性和定量分析：由GC-MS得到的色谱图，经计算机在标准谱库NIST 8.0中比对检索，选取相似度>80(最大值为100)的物质进行定性分析，并准确地鉴定出各样品的挥发性成分，同时采用庚酸甲酯(640 μg/L)为内标进行半定量分析，得到各组分的质量浓度[14]。

1.3.3 泡萝卜的感官评价

参考姚月华等[15]的方法略作修改。

使用FP法进行泡萝卜感官评价。由15名感官评价人员对6种发酵剂发酵的泡萝卜进行感官评价，从外观、香气、风味、余味等各方面尽可能多地产生样品间差异的感官描述词。然后通过讨论来合并、删除描述词，最终形成泡萝卜的感官描述词汇表。每位评价员从这些描述词中选择自己能感知到差异的描述词单独进行评价。评价表上有若干条15 cm长的非结构线性标度，每条标度从左到右表示感官性质由弱到强。评价员在再次品尝泡菜样品的过程中，根据自己所选择的性质，将样品编号在标度上进行强度排序。评价结束后，收集所有评价表，测量从标度最左端到样品标注点的距离(cm)，此距离即为样品感官性质的强度。

1.3.4 统计学分析

使用SPSS 18.0软件对数据进行统计学分析，每组试验重复3次，实验数据表示为平均值±标准偏差。Origin 2018进行图表绘制。FP法得到的感官数据使用XLSTAT 2016软件对进行广义普鲁克分析(generalized procrustes analysis，GPA)和层次聚类分析(agglomerative hierarchy clustering，AHC)。

2 结果与分析

2.1 不同发酵剂发酵泡萝卜挥发性风味成分分析

采用SPME-GC-MS测定6种泡萝卜中的挥发性风味成分。结果表明，6种不同发酵剂发酵的泡萝卜中共测得75种挥发性风味物质，包括酯类12种、醇类27种、萜烯类5种、酸类10种、醛酮类4种、烷烃类4种和其他13种(附表1，https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CAPJ & dbname=CAPJLAST & filename=SPFX20220530002)。不同发酵剂泡萝卜样品，其挥发性风味成分的种类和相对含量均具有明显不同，S、W、ZFK、L、ZB、HS这6种发酵剂发酵的泡萝卜在发酵7 d后，依次检测到30、29、28、23、29、40种化合物(表1)，挥发性成分含量依次为(3.01±0.82)、(5.42±1.34)、(1.25±0.77)、(2.31±0.77)、(10.22±10.18)、(21.63±13.85) μg/g，其中HS发酵剂的挥发性成分的含量和种类最丰富。

醇类物质具有令人愉悦的香气，是能提高总体喜好度和发酵香喜好度的主要香气物质，发酵过程中菌群结构复杂，酵母菌的代谢旺盛积累了大量醇类物质[14]。由附表1可知，只在W中检测出了异戊醇，异戊醇具有烘托酯香的作用，能够使香味更丰腴[16]。6种发酵剂泡萝卜都产生了桉叶油醇，桉叶油醇具有一股清凉的气息，在ZB和HS中的含量较高，6种泡萝卜的桉叶油醇含量有较大差异可能是由于发酵剂的菌种组成不同[17]。芳樟醇是蔬菜中常见的易挥发化合物，具有较低的香气阈值，即使在很低浓度下也可能对食品的香气有较大的贡献[18]。在HS中含量显著高于其他5种发酵剂泡萝卜(P<0.05)。张华芳等[19]发现泡菜发酵过程中，醇类化合物中芳樟醇的含量较高，说明了芳樟醇是泡菜发酵产生的重要挥发性物质。酯类物质是相对含量较大的一类物质，是泡萝卜的主体风味物质之一[20]。ZB检测到的异硫氰酸苯酯和HS检测到的异硫氰酸苯乙酯的含量显著高于其他5种发酵剂泡萝卜(P<0.05)。异硫氰酸酯类被认为是十字花科植物及其发酵成品特有的风味物质，阈值极低，低浓度时呈现令人愉悦的香味[21]。可能引起HS和ZB的泡萝卜风味明显区别于其他的发酵剂泡萝卜。酸类物质是由于乳酸菌的代谢旺盛，通过乳酸发酵途径大量产生[20]。在6种发酵剂泡萝卜中都检测出了乙酸，ZB中的乙酸在6种发酵剂泡萝卜中最高。乙酸产生的原因是发酵过程中进行异型乳酸发酵的菌株的代谢产物有一部分是乙酸，可以改善泡菜的风味并增加酸味，对泡萝卜的风味有着重要的影响[22]。萜烯类化合物具有呈香或呈味作用，除了单萜和少量的倍半萜外，大部分萜烯类物质还呈现一定的苦味。HS中共检测出5种萜烯类化合物(右旋萜二烯、月桂烯、萜品油烯、姜黄烯和萜品烯)，ZB中只检测出了右旋萜二烯，但在S、W、ZFK和L均未检测出任何萜烯类化合物，所以HS萜烯类化合物香气成分比另外5种泡萝卜丰富。发酵中产生的醛类化合物来源于发酵过程中的脂质氧化，醛类化合物的阈值低，具有特殊香气[23]。ZB中检测出的2，4-二甲基苯甲醛含量高于其他5种发酵剂泡萝卜。6种泡萝卜中的烷烃类物质含量都相对较少，香气阈值比较高，即对泡萝卜的风味贡献较低。

6种发酵剂泡萝卜挥发性成分主要物质为醇类、酯类、酸类和萜烯类(表1)。王芮东等[17]也发现泡菜在发酵过程中醇类和酯类的含量较高。此结果与陈大鹏等[24]在研究娃娃菜纯种发酵及自然发酵过程中香气成分及含量的变化中发现发酵过程中醇类、酯类和酸类是主要风味物质的结论相一致。在6种发酵剂泡萝卜中，HS的香气物质最丰富且相对含量较高，表明HS产品风味要优于其他发酵剂的泡萝卜。

表1 六种发酵剂发酵的泡萝卜挥发性成分含量

2.2 挥发性成分与菌种相关性分析

采用高通量测序技术探索6种风味优质的泡菜卤水发酵的泡菜(发酵7 d)的微生物结构，确定了关键微生物群落，并对样品的细菌和真菌多样性进行了系统分析[13]，如图1所示。

a-HS发酵剂泡萝卜；b-L发酵剂泡萝卜；c-S发酵剂泡萝卜；d-W发酵剂泡萝卜；e-ZB发酵剂泡萝卜；f-ZFK发酵剂泡萝卜

将微生物群落信息与泡萝卜挥发性成分进行聚类分析得到，在细菌物种水平上(图1)，HS发酵剂泡萝卜中巴氏假单胞菌水平与醇类和酯类挥发性物质呈显著正相关(P<0.01)，肠杆菌属、沙雷氏菌、气单胞菌属和植物乳杆菌水平与酸类呈显著正相关(图1-a)。L发酵剂泡萝卜中布氏乳杆菌、植物乳杆菌、牛痘乳杆菌、巴氏醋酸杆菌和红色红球菌水平与萜烯类挥发性物质呈显著正相关(图1-b)。S发酵剂泡萝卜中植物乳杆菌与酯类物质呈显著正相关，大黄欧文菌和巴氏假单胞菌水平与萜烯类挥发性物质呈显著正相关，耐酸乳杆菌和乙醇乳球菌水平与醇类和酸类挥发性物质呈显著正相关(图1-c)。W发酵剂泡萝卜中耐酸乳杆菌水平与酸类、醇类和酯类挥发性物质呈显著正相关(图1-d)。ZB发酵剂泡萝卜中沙雷氏菌水平与酯类和酸类挥发性物质呈显著正相关(图1-e)。ZFK发酵剂泡萝卜中腐败希瓦氏菌水平与萜烯类挥发性物质呈显著正相关(图1-f)。综上所述，耐酸乳杆菌、植物乳杆菌、沙雷氏菌为主要细菌组成，与醇类、酯类、酸类和萜烯类化合物显著正相关。HU等[25]探究传统发酵香肠中细菌群落与挥发性化合物的相关性，发现植物乳杆菌与酸类、醇类和酯类物质呈正相关性。由此可得，乳酸菌对泡萝卜风味形成具有重要作用。YANG等[26]通过Spearman的相关性分析，探索了微生物群与挥发组图谱之间的潜在相关。结果表明，乳酸菌与大多数挥发性化合物呈正相关，与本次实验结果相符合。

6种发酵剂中真菌与挥发性化合物含量变化的聚类分析热图如图2所示。

a-HS发酵剂泡萝卜；b-L发酵剂泡萝卜；c-S发酵剂泡萝卜；d-W发酵剂泡萝卜；e-ZB发酵剂泡萝卜；f-ZFK发酵剂泡萝卜

将图2发酵菌剂中真菌与挥发性化合物含量变化的聚类分析热图与图1发酵剂中细菌与挥发性化合物含量变化的聚类分析热图进行比较，真菌与挥发性成分的相关性总体上较弱，说明真菌在泡萝卜发酵中的作用较小。HS发酵剂泡萝卜中炭疽病菌属水平与酸类挥发性物质呈显著正相关(P<0.01)，铜绿梭菌水平与醇类和酯类挥发性物质呈显著正相关(图2-a)。L发酵剂泡萝卜中毕赤酵母属水平与萜烯类挥发性物质呈显著正相关(图2-b)。S发酵剂泡萝卜中丝状杆菌水平与萜烯类挥发性物质呈显著正相关，毕赤酵母属水平与醇类和酸类挥发性物质呈显著正相关(图2-c)。W发酵剂泡萝卜中曼氏毕赤酵母水平与酸类、醇类和酯类挥发性物质呈显著正相关，东方伊莎菌和毕赤酵母属水平与萜烯类挥发性物质呈显著正相关(图2-d)。而ZB发酵剂泡萝卜和ZFK发酵剂泡萝卜中的真菌与泡菜中的主要挥发性物质相关性较弱(图2-e，图2-f)。综上所述，毕赤酵母属是主要真菌组成，与醇类、酸类和萜烯类化合物显著正相关。SHANG等[27]研究发现毕赤酵母是占主导地位的真菌属，与挥发性酸，酯类高度相关。RAO等[28]探究了用陈年盐水发酵的萝卜的微生物多样性和风味的特征，也发现了在真菌组成中毕赤酵母是主要真菌属。由此可见，毕赤酵母作为大多数样本中的优势真菌属，与多种挥发性物质具有显著的相关性。

2.3 挥发性成分与菌种相关性分析

15位评价人员共产生了55个感官属性描述词(图3-a)。评价人员各自选择了6～12个(人均8个词)感官属性描述词对样品进行FP法评价。研究发现，评价人员选择最多的词分别为脆性(te)、酸味(f)、咸味(f)、辣味(f)。说明这4个感官属性描述词是样品最突出的性质，最易被评估员感知、选择。对6种泡萝卜的FP法的结果进行GPA，FP法主要是在样品之间存在感官差异的基础上，对样品进行强度排序，可以得到泡萝卜样品的感官载荷图(图3-b)。F1与F2共解释了总变量的56.08%，样品位置越近，表示两者的感官性质越相似。从图4可知，6个样品的感官属性差异较大，L与ZB样品位置相对最近，说明这两种泡萝卜的感官性质最类似。ZFK与S样品位置相对最远，说明这两种泡萝卜的感官性质差异最大。

a-词云图；b-GPA载荷图

根据FP法的结果获得的描述符合样本的CPA(图4)，显示了6种泡萝卜中的ZFK位于“咸味(f/af)”群组附近，说明这种泡萝卜在咸味(f/af)方面表现突出，由于发酵过程中产生的某种物质加快了体系中食盐在泡萝卜中的渗透和迁移作用，导致萝卜组织中盐分含量增加，从而增加了产品咸味。张慧敏等[29]研究乳酸对直投式发酵泡萝卜盐度的变化，发现添加乳酸导致萝卜组织中盐分含量增加。ZB和HS泡萝卜附近都出现了“辣味(f)”，但发酵前并未加入任何香辛料，是由于异硫氰酸酯类物质含量较高，从而使得泡萝卜具有辛辣的口感[20]。样品ZB位于“酸味(f)”群组附近，可见这种泡萝卜在酸味(f)方面表现接近，这可能与ZB中乙酸的含量最高有关，使评价员评价ZB样品时，能清楚感知到酸味(f)的感官属性。ZFK和S位于“脆性(te)” 群组附近，推测由于这两种泡萝卜中酸类物质含量较低，咀嚼性更大，泡萝卜口感更加清脆[30]。HS样品附近感官属性词最为密集，表明了评价员在评价HS时所产生的感官描述词最为丰富。所以，HS的泡萝卜的感官品质更好。

a-描述符；b-GPA图

3 结论

以萝卜为原料用6种发酵剂发酵泡菜，探究不同泡萝卜的挥发性组分和感官品质的变化。实验结果表明，6种不同发酵剂泡萝卜中共测得75种挥发性风味物质(酯类12种、醇类27种、萜烯类5种、酸类10种、醛酮类4种、烷烃类4种和其他13种)，主要为醇类、酯类、酸类和萜烯类。HS发酵剂泡萝卜香气物质的种类最丰富且相对含量较高，表明HS发酵剂泡萝卜产品风味要优于其他发酵剂的泡萝卜。分析探讨6种发酵剂泡菜中细菌和真菌种类与挥发性成分的相关性，发现细菌比真菌与挥发性成分的相关性总体上较强。植物乳杆菌、耐酸乳杆菌和沙雷氏菌是泡萝卜发酵过程中的重要细菌组成。毕赤酵母是泡萝卜发酵过程中的主要真菌组成。通过FP法进行感官评价，其中脆性(te)、酸味(f)、咸味(f)、辣味(f)是样品最突出的性质，最易被评估员感知与选择。综上实验结果，发酵剂HS发酵的泡菜风味更好。同时，将6种发酵剂中对风味有促进作用的菌种复合发酵更有利于得到高品质泡菜。