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不同抗氧化剂对皮肤抗氧化效果的对比研究

2023-03-07吴昱萱刘昌树刘建国李可欣刘大松周鹏

食品与发酵工业 2023年4期
关键词:球藻针叶抗氧化剂

吴昱萱,刘昌树,刘建国,李可欣,刘大松*,周鹏

1(食品科学与技术国家重点实验室(江南大学),江苏 无锡,214122)2(佳格食品(中国)有限公司,江苏 苏州,215000)

紫外线是导致皮肤老化的重要外源性因素,其中对人体皮肤造成损害的主要是UVA(320~400 nm)和UVB(290~320 nm)波段[1]。UVA和UVB诱导机体过度产生活性氧(reactive oxygen species,ROS)是导致皮肤损伤的重要原因,ROS积累使得内源性抗氧化系统受损,机体趋于氧化应激状态,进一步刺激基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)上调, MMPs能降解大部分的细胞外基质,如胶原蛋白、弹性蛋白[2]。另一方面,ROS在促炎信号级联反应中充当第二信使,在机体处于氧化应激状态时,可刺激产生促炎细胞因子,加剧炎症反应[3-4]。机体最终表现出泛红、干燥、缺乏弹性、皱纹加深等一系列皮肤损伤,严重影响人们的外表自信。随着审美水平的不断提高,预防和延缓紫外线导致的皮肤老化显得十分必要。

氧化应激能引发皮肤基质的降解和炎症因子的激增,最终导致皮肤老化。核因子红细胞系-2相关因子2/抗氧化反应元件(nuclear factor erythroid-2 related factor 2/ antioxidant response element,Nrf2/ARE) 信号通路是调节氧化还原平衡的重要途径,可控制下游多种抗氧化酶的表达,从而清除ROS,中和过氧化产物,维持氧化还原稳态,在保护皮肤免受紫外线诱导的氧化损伤方面发挥着重要的作用,因而以Nrf2/ARE信号通路为作用靶点的天然抗氧化剂是抗皮肤光老化的潜在原料[5-6]。

因此,本研究以石榴提取物、雨生红球藻提取物、针叶樱桃提取物、维生素E这4种常用的天然抗氧化剂为原料,以UVA+UVB紫外线造模的裸鼠为研究对象,比较不同抗氧化剂灌胃处理对皮肤抗氧化效果的影响,以期为具有皮肤改善效果产品的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红石榴浓缩粉(安石榴甙:33.2%,鞣花酸:1.1%),西班牙Euromed公司;雨生红球藻虾青素微囊粉(虾青素:2.4%),大连医诺生物股份有限公司;针叶樱桃浓缩粉(维生素C:18%),浙江天草生物制品有限公司;天然维生素E粉(混合生育酚浓缩物:30.96%),陕西海斯夫生物工程有限公司;BALB/c Nude裸鼠(SPF级、7周龄、雄性),维通利华实验动物有限公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)试剂盒,南京建成生物研究所;ROS试剂盒,上海贝博生物科技有限公司;谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、蛋白质羰基(protein carbonyl,PC)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、基质金属蛋白酶-1、9、12(matrix metalloproteinase-1、9、12,MMP-1、9、12)Elisa试剂盒,上海酶联生物科技有限公司;总蛋白试剂盒,美国Thermo Scientific公司;组织总RNA提取、反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)、SYBR qPCR Master Mix试剂盒,南京诺唯赞生物科技有限公司;其他实验试剂均为分析纯,购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

UVA紫外灯管(波长320~400 nm,峰值波长340 nm)、UVB紫外灯管(波长290~320 nm,峰值波长313 nm),荷兰皇家飞利浦公司;UV-313/UV-340双通道紫外辐照计,北京师大光电技术有限公司;皮肤弹性测试仪,德国Courage+Khazaka Electronic GmbH(CK)公司产品;CR-700 d色彩色差计,柯尼卡美能达(中国)投资有限公司;Nanodrop One/OneC型分光光度计、Multiskan Sky型酶标仪,美国Thermo Scientific公司;ETC811型PCR扩增仪,北京东胜生物科技有限公司产品;LightCycler96实时荧光定量PCR仪,瑞士Roche公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物实验分组及处理

1.3.1.1 动物分组

适应性喂养1~2周后, 60只BALB/c Nude裸鼠随机分为6组(n=10):(1)空白组,灌胃等体积生理盐水;(2)模型组,灌胃等体积生理盐水;(3)石榴组,灌胃292 mg/kg bw红石榴浓缩粉(即安石榴甙和鞣花酸为100 mg/kg bw);(4)雨生红球藻组,灌胃103 mg/kg bw雨生红球藻虾青素微囊粉(即虾青素为2.5 mg/kg bw);(5)针叶樱桃组,灌胃556 mg/kg bw针叶樱桃浓缩粉(即维生素C为100 mg/kg bw);(6)针叶樱桃+维生素E组,灌胃556 mg/kg bw针叶樱桃浓缩粉和2.66 mg/kg bw天然维生素E粉(即维生素C为100 mg/kg bw,混合生育酚为0.82 mg/kg bw)。灌胃体积为10 mL/kg,灌胃样品用生理盐水现配现用。除正常组,其余均进行UV暴露处理,在饲养期间记录小鼠体重变化与健康状态。

1.3.1.2 光老化模型建立

根据文献与预实验确定[19]:两支 UVA灯管和一支UVB灯管营造紫外线环境。紫外灯开启稳定30 min后利用紫外辐照计测定紫外线辐照强度。将小鼠放入5 cm×9 cm×4 cm的透明小盒子中,盒子顶部用1 cm×1 cm铁丝网固定小鼠,灯距离小鼠背部距离为30 cm。每周照射3次,连续2周,每次辐照剂量为5 600 mJ/cm2,UVA、UVB辐照强度分别1.44、0.14 mW/cm2。本次动物实验伦理经江南大学动物伦理委员会认可,审核编号为JN.No20210630b0800812[236]。

1.3.1.3 样品采集

实验结束后,禁食不禁水12 h,异氟烷麻醉,摘眼球取血,3 500 r/min,4 ℃离心15 min,取上层血清保存于-80 ℃。取背部皮肤约0.1 g加入0.9 mL预冷的生理盐水,利用快速研磨仪制成10%组织匀浆,3 000 r/min,4 ℃离心15 min,取上清液保存于-80 ℃。

1.3.2 指标测定

1.3.2.1 小鼠脾脏指数测定

取脾脏用滤纸擦干称重,根据公式(1)计算脾脏指数:

(1)

1.3.2.2 血清、皮肤氧化应激和抗氧化酶指标测定

血清、皮肤组织上清液ROS、MDA、PC、SOD、GHS-Px、CAT根据试剂盒说明书进行测定。

1.3.2.3 皮肤Nrf2/ARE信号通路相关基因RT-PCR测定

根据试剂盒提取皮肤总RNA,测定浓度和纯度,对OD260nm/OD280nm=1.8~2.0的样品调整到相同浓度后逆转录为cDNA,采用RT-PCR扩增测定Nrf2、血红素加氧酶-1 (heme oxygenase-1,HO-1)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸醌氧化还原酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphatequinone oxidoreductase1,NQO1)的相对表达。引物信息如表1所示。

表1 RT-PCR引物序列

1.3.2.4 皮肤胶原降解指标测定

皮肤组织上清液MMP-1、9、12根据试剂盒说明书进行测定。

1.3.2.5 血清炎症因子测定

血清IL-6、TNF-α根据试剂盒说明书进行测定。

1.3.2.6 皮肤表观指标测定

分别利用色差计和皮肤弹性测试仪测定小鼠同一部位背部皮肤的a*、总弹性、净弹性。取约0.1 g背部皮肤根据GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》测定皮肤水分。

1.4 数据处理

利用SPSS 26.0软件,运用LSD和Tukey进行组间方差分析,结果均以“平均值±标准差”来表示,P<0.05表示组间具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 不同抗氧化剂对小鼠生长指数的影响

由图1可知,体重整体呈上升趋势,其中石榴组体重下降,但该组饲养和解剖中也未发现其明显异常,其体重下降原因可能与石榴提取物及其代谢产物具有降脂效果有关[20]。各组脾脏指数无显著性差异(P>0.05)。

a-体重;b-脾脏指数

2.2 不同抗氧化剂对小鼠氧化还原稳态的影响

2.2.1 不同抗氧化剂对小鼠氧化应激程度的影响

紫外线照射诱导机体产生过量的ROS攻击细胞膜,生物大分子被破坏,大量的脂质、蛋白质过氧化氧化产物积累,如MDA和蛋白质羰基,由此加快皮肤结构损伤[21]。如图2所示,较空白组,紫外线照射导致模型组ROS、PC含量显著增加,石榴显著减少PC含量,针叶樱桃显著减少MDA含量,雨生红球藻显著减少ROS和PC含量,而针叶樱桃+维生素E能显著减少三者的含量(P<0.05)。说明石榴、雨生红球藻、针叶樱桃、针叶樱桃+维生素E干预能够降低紫外线照射导致的氧化损伤,其中针叶樱桃+维生素E的效果较好,雨生红球藻次之。前人研究已表明,摄入虾青素[10]、维生素C[13]、维生素E[22]可降低体内氧化应激程度,进而保护皮肤免受损伤,但仅对单一抗氧化剂进行研究,未进行多种抗氧化剂之间的体内对比。

a-血清活性氧荧光强度;b-皮肤MDA含量;c-皮肤蛋白质羰基含量

2.2.2 不同抗氧化剂对小鼠皮肤抗氧化酶的影响

内源性抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)能够抵消机体产生的ROS,维持氧化还原平衡,当紫外线照射产生ROS超出内源性抗氧化防御系统的调节能力时,动态平衡被打破,进而导致皮肤细胞氧化损伤,加剧皮肤光老化[3]。由图3所示,较空白组,模型组GSH-Px、CAT显著下调(P<0.05),说明紫外线照射消耗机体内源性抗氧化酶;较模型组,雨生红球藻显著提高GSH-Px表达量,针叶樱桃+维生素E可显著提高GSH-Px、CAT表达量(P<0.05),这与上述氧化应激的结果相对应。雨生红球藻是天然虾青素的理想来源,虾青素由于其“极性-非极性-极性”的结构特性,使其可以跨膜穿插在脂质双分子层中,兼具亲水区和疏水区捕获自由基的能力,使得少量的虾青素即可达到较高剂量普通抗氧化剂的效果[23]。针叶樱桃提取物富含维生素C,与维生素E在皮肤抗氧化方面是相互依赖的关系,维生素C是水溶性,存在于细胞质,维生素E为脂溶性,存在于细胞膜,紫外线照射产生的自由基攻击细胞膜,诱导过氧化连锁反应的发生,同时维生素E作为抗氧化剂转变为维生素E自由基,后者被维生素C还原为维生素E,二者的协同再生作用可能是其效果优于其他干预组的原因[14]。FUCHS等[15]也证实,维生素C和维生素E协同作用优于单独作用。提示亲水和亲脂互补可增强氧化应激的改善效果。

a-皮肤超氧化物歧化酶表达量;b-皮肤谷胱甘肽过氧化物酶表达量;c-皮肤过氧化氢酶表达量

2.2.3 不同抗氧化剂对小鼠皮肤Nrf2/ARE信号通路的影响

Nrf2/ARE是维持氧化还原平衡的重要调控通路,在外界刺激下, Nrf2移位进入细胞核,并结合抗氧化反应元件ARE,转录激活下游抗氧化酶,如NQO1、HO-1[24]。由图4所示,较空白组,模型组NQO1相对表达量显著下调,较模型组,针叶樱桃+维生素E、石榴分别显著上调Nrf2、HO-1相对表达量(P<0.05)。上述结果说明各抗氧化剂可通过调节氧化还原通路中相关因子表达,来提高皮肤抗氧化效果和抑制氧化损伤,与LOHAKUL等[25]研究结果相似。

a-皮肤Nrf2的mRNA相对表达量;b-皮肤HO-1的mRNA相对表达量;c-皮肤NQO1的mRNA相对表达量

2.3 不同抗氧化剂对小鼠皮肤胶原降解代谢的影响

真皮中最为丰富的成分是胶原蛋白,胶原蛋白的类型以Ⅰ和Ⅲ型为主,胶原蛋白交织成胶原纤维平行于皮肤表面,赋予皮肤抗拉强度;微纤维成分包埋在弹性蛋白中形成弹性纤维,维持皮肤弹性[1]。当机体处于氧化应激状态时会激活一系列信号转导途径,如丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路,诱导下游MMPs表达,将胶原、弹性蛋白大分子降解为片段化,失去抗拉和弹性结构[2]。其中MMP-1、9是降解Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白的主要活性蛋白[2];MMP-12除了能够降解弹性蛋白,还能够激活其他MMPs家族成员,加速细胞外基质降解的级联反应[1]。如图5所示,较空白组,模型组MMP-1、9、12均显著增加,较模型组,石榴、雨生红球藻、针叶樱桃、针叶樱桃+维生素E可显著减少MMP-1、9或12(P<0.05),说明各抗氧化剂均可抑制MMPs表达,维持胶原蛋白和弹性蛋白稳定性,延缓皮肤老化,其中针叶樱桃+维生素E效果较好,这可能得益于其良好的抗氧化效果。不仅如此维生素C作为脯氨酸羟化酶、赖氨酰羟化酶的辅助因子,还能够促进胶原蛋白合成,这已得到JEONG等[26]的证实。

a-皮肤基质金属蛋白酶-1表达量;b-皮肤基质金属蛋白酶-9表达量;c-皮肤基质金属蛋白酶-12表达量

2.4 不同抗氧化剂对小鼠机体炎症的影响

ROS积累促使核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)活化,介导下游促炎细胞因子分泌,进而刺激炎症反应,导致皮肤泛红,另外炎症不仅会加剧ROS生成,而且又会促进MMPs表达,加重皮肤损伤[4]。由图6所示,较空白组,模型组IL-6、TNF-α含量显著增加,雨生红球藻显著减少IL-6和TNF-α含量,针叶樱桃+维生素E干预可显著减少IL-6含量(P<0.05),说明雨生红球藻和针叶樱桃+维生素E可抑制促炎因子表达,改善皮肤炎症。该结果与上述雨生红球藻和针叶樱桃+维生素E提高皮肤氧化还原稳态以及抑制胶原降解的结果相一致。MELO等[4]也表明摄入含有酚类抗氧化成分的马鞭草提取物可通过调节抗氧化-炎症-胶原代谢三者关系,改善紫外照射导致的皮肤损伤。

a-IL-6含量;b-TNF-α含量

2.5 不同抗氧化剂对小鼠皮肤表型的影响

色差a*值代表红绿值(红色>0,绿色<0),用以表征紫外照射导致的皮肤色差变化,过度暴露于紫外会导致皮肤泛红,是皮肤炎症的外在表现。由图7可知,较空白组,模型组a*值显著升高,较模型组,石榴、雨生红球藻、针叶樱桃、针叶樱桃+维生素E显著下调a*值(P<0.05),直观地反映了各抗氧化剂具有一定的皮肤炎症改善效果。这与STAHL等[17]研究结果相似,即摄入抗氧化剂后可改善紫外照射导致的皮肤泛红。除此之外,干燥、松弛也是常见的皮肤光老化问题,表现为水分流失以及弹性下降,石榴干预使得水分显著增加(P<0.05),但皮肤弹性未见显著性改善,可能是由于干预时间过短而未能体现在皮肤表型上。

a-皮肤色差a*值;b-皮肤水分含量;c-皮肤总弹性;d-皮肤净弹性

3 结论

本研究利用UVA+UVB联合紫外照射建立小鼠皮肤光老化模型,准确真实地比较常见抗氧化剂对皮肤的改善效果。结果显示,口服摄入抗氧化剂不仅具有上调抗氧化酶表达,减少氧化产物积累,平衡皮肤氧化还原调节的作用,其中雨生红球藻和针叶樱桃+维生素E效果较好。而且雨生红球藻和针叶樱桃+维生素E在抑制胶原、弹性蛋白降解相关酶和促炎因子的分泌上也表现出最优性,并使皮肤泛红程度下降。上述结果可为今后开发护肤产品提供原料选择,提升产品抗皮肤光老化效果,提高市场竞争力。

本文主要采用了单一天然抗氧化剂及其组合,进行皮肤抗氧化效果的对比研究,在后续的研究中,可考虑复配其他皮肤功效成分,如活性多肽,探究在维持皮肤健康方面是否有协同功效。此外,各抗氧化剂经体内消化吸收后的产物及其护肤作用机理,还可进一步研究。

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