胸水细胞学标本SHOX2 和RASSF1A 基因甲基化预测肺腺癌的临床价值

纪燕英，高锦添，王德玉

（中山大学第三附属医院病理科，广州 510000）

肺腺癌是较常见的一类肺癌，起源于气管、支气管黏膜或腺体最常见肺部疾病的一类恶性肿瘤，有一定的遗传易感性[1‐2]。其高死亡率可归因于晚期诊断。早期肺腺癌预后较好，但患者无特殊症状，难以及时发现并引起重视。早发现、早诊断、早治疗是提高肺腺癌患者生存率的关键，因此探寻高效的肺腺癌检查诊断方式，提升肺腺癌早期确诊率仍是临床研究的重要课题。

矮小同源盒基因2（dwarf homeobox gene,SHOX2）和RAS 相关区域家族1A（RAS related region family 1A, RASSF1A）启动子的异常甲基化已被验证为诊断早期肺腺癌的一对有价值的生物标志物[25]。既往国内外报告多使用肺结节穿刺标本及支气管肺泡灌洗液作为研究对象，结果均提示侵袭性病变中的SHOX2 和RASSF1A 启动子甲基化程度均明显高于非侵袭性病变[15,20]。另一方面，胸水细胞学标本的SHOX2、RASSF1A 临床数据却非常有限。相比肺活检穿刺术和支气管肺泡灌洗术，胸水标本采集显然创伤性更小、安全性更高、可重复操作。因此，本研究拟将可疑肺腺癌患者作为干预对象，比较良性病变和肺腺癌间可疑恶性胸水的胸水细胞学标本SHOX2、RASSF1A 基因甲基化结果差异，并且联合细胞学诊断结果，旨在探析两项指标在肺腺癌病情预测诊断中的应用，以期为肺腺癌临床检查诊断方式的选择提供参考依据。

资料与方法

1 一般资料与标本

选择2022 年1 月—2022 年12 月，中山大学附属第三医院送检的80 例胸水标本作为研究对象，按胸部CT、X 线、磁共振或病理学检查结果的不同分为观察组（40 例，可疑肺腺癌）和对照组（40 例，良性病变）。观察组，男:女=24:16，年龄29～83岁，平均66.4 岁；对照组，男:女=32:8，年龄21～91岁，平均60.6 岁，病症类型肺结核:肺炎:占位肿物=4:18:20。

2 肺腺癌筛查标准

符合《肺癌筛查与管理中国专家共识》[7]中肺腺癌诊断标准，有胸痛、咳嗽、咯血等症状，胸部CT、X 线、磁共振及病理学检查提示肺腺癌。

3 纳入和排除标准

纳入标准：①年龄≥18 岁；②既往或目前胸部CT、X 线、磁共振或病理学检查（细胞学或组织学）提示肺癌；③基本资料齐全。

排除标准：①有全身免疫性疾病、精神疾病；②存在严重感染性、传染性疾病；③合并其他呼吸道疾病（如变异性哮喘、支气管狭窄等）。

4 方法

4.1 试验设备、试剂

BD CytoRich 样本保存液，碧迪公司；CK7、TTF‐1、NapsinA、WT1、P40、CK5/6 即用型抗体，福州迈新生物技术开发有限公司；全自动免疫组化染色系统，美国罗氏，型号BenchMark ULTRA；医用离心机，珠海顺皓生物科技有限公司，型号H1650‐W；全自动医用PCR 分析系统,上海宏石医疗科技有限公司,型号SLAN‐96S；LifeECO 基因扩增仪，杭州博日科技有限公司,型号TC‐96/G/H(b)C；荧光计，杭州奥盛仪器有限公司，型号Fluo‐100B；细胞保存液，上海透景生命科技股份有限公司；核酸抽取或纯化试剂盒，上海透景生命科技股份有限公司；人SHOX2、RASSF1A 基因甲基化DNA 试剂盒测试剂盒（PCR 荧光法），上海透景生命科技股份有限公司

4.2 指标检测

采集胸水细胞学标本：收集50 ～100 mL 胸水，其中20 mL 胸水加入细胞保存液，剩余胸水离心处理（10 min，2000 r/min）并去除上清液后加入20 mL BD 样本保存液；如果不能立即检测，样本保存于2‐8°冰箱；

细胞学染色：去上清液后的细胞沉渣进行液基细胞染色检测操作及细胞蜡块的制作，并进行巴氏、HE 染色，必要时加做免疫组织化学染色协诊；

液基细胞学、细胞蜡块及免疫组化病理诊断：有两名经验丰富的高年资病理医生诊断。

甲基化DNA 提取：离心处理（10 min，2000 r/min）并去除上清液，每份样本均可见芝麻大小沉淀物，细胞沉淀物采用DNA 提取试剂（离心柱形），离心、洗涤处理（严格按照试剂盒说明书操作），收集DNA。

亚硫酸盐修饰：取20 μL DNA 样本进行转化、洗涤及DNA 修复处理（严格按照试剂盒说明书操作），修饰后DNA 立即用于检测；

甲 基 化 检 测： 用 人SHOX2、RASSF1A 基因甲基化DNA 试剂盒测试分析修饰后DNA。修饰后基因测序引物为SHOX2 上游5’‐GGT‐GTTGTGTCGTATAGGGAGT‐3’、 下 游5’‐TC‐CGCCTCCTACCTTCTAAC‐3’；RASSF1A 上游5’‐GAGGGAAGGAAGGGTAAGG‐3’、 下 游5’‐GAGGGAAGGAAGGGTAAGG‐3’。进行实时荧光定量PCR 检测，PCR 反应体系：PCR 反应液15（n+2）μL 与DNA 聚合酶0.3（n+2）μL（n 代表样本数量）混匀后取15 μL 及5 μL DNA 样本加入反应管，颠倒混匀、瞬时离心；扩增程序：第1 阶段95 ℃ 10 min，1 个循环，第2 阶段95 ℃ 15 s，60 ℃30 s，5 个循环，第3 阶段95 ℃ 15 s、57 ℃ 30 s，40 个循环；信号收集。

阳性判读值：FAM 荧光信号的扩增曲线为光滑的“S”形，且Ct 值＜35，提示RASSF1A 基因甲基化阳性；VIC（或HEX）荧光信号的扩增曲线为光滑的“S”形，且Ct 值＜32，提示SHOX2 基因甲基化阳性；用△Ct 法计算SHOX2、RASSF1A 甲基化表达水平，△Ct 值越低，基因甲基化水平越高。

5 统计学方法

采用SPSS 26.0 统计学软件处理数据，计数资料用%表示组间行χ2检验；计量资料符合正态分布数据用表示，组间比较采用独立样本t 检验；Logistic 回归分析SHOX2、RASSF1A 甲基化与肺腺癌病情的关系；绘制受试者工作特征（ROC）曲线分析SHOX2、RASSF1A 甲基化在肺腺癌病情诊断中的应用。P＜0.05 差异有统计学意义。

结 果

1 两组细胞学病理诊断结果

观察组中可疑恶性胸水液基巴氏染色及细胞蜡块HE 染色片中找到腺癌细胞或核异质细胞，结合细胞蜡块免疫组织化学染色napsinA (+)、TTF‐1 (+)、CK7 (+)、WT1 (‐)，证实为肺腺癌（图1）。

图1 肺腺癌胸水液基巴氏、细胞蜡块HE 染色与免疫组织化学表型。A；液基巴氏染色；B，细胞蜡块HE 染色；C，napsinA ；D，TTF‐1 ；E，CK7 ；F，WT1；箭头，腺癌细胞；比例尺，50 μmFig. 1 Liquid based Pap staining of lung adenocarcinoma pleural fluid, HE staining of cell wax block and immunohistochemical phenotype. A, liquid based Pap staining; B, cell wax block HE staining; C, napsin A ; D, TTF‐1 ; E, CK7 ; F, WT1; arrows, adenocarcinoma cells; scale bar, 50 μm

对照组中良性胸水液基巴氏染色及细胞蜡块HE 染色中未见确切癌细胞，结合细胞蜡块免疫组织化学染色napsin A(‐)、TTF‐1(‐)、CK5/6 (散在+)、P40(‐)，证实胸水为良性病变（图2）。

图2 良性胸水液基巴氏、细胞蜡块HE 染色与免疫组织化学表型。A，液基巴氏染色；B，细胞蜡块HE 染色；C，napsinA；D，TTF‐1；E，CK5/6；F，P40；比例尺，50 μmFigure 2 Liquid based Pap staining of benign pleural fluid, HE staining of cell wax block and immunohistochemical phenotype. A, liquid based Pap staining; B, cell wax block HE staining; C, NapsinA; D, TTF‐1; E, CK5/6; F, P40; scale bar, 50 μm

2 比较两组的SHOX2、RASSF1A 基因甲基化检测情况

观察组的SHOX2、RASSF1A 基因甲基化检测值低于对照组（表1）。

表1 比较两组的SHOX2、RASSF1A 基因甲基化检测值Tab. 1 Comparison of SHOX2 and RASSF1A gene methylation detection values between two groups

3 肺腺癌的多因素Logistic 回归分析

视临床或病理学检查结果为标准，观察组诊断为肺腺癌，患者的性别、年龄，差异无统计学意义（表2）。

表2 观察组SHOX2、RASSF1A 表达水平的比较Tab. 2 Comparison of the expression levels of SHOX2 and RASSF1A in the observation group

以SHOX2、RASSF1A 甲基化表达水平为自变量，连续变量；将观察组甲基化结果作为因变量，进行Logistic 回归分析，结果显示，SHOX2、RASSF1A甲基化高表达是肺腺癌危险因素（表3）。

表3 SHOX2、RASSF1A 甲基化与肺腺癌病情的Logistic 回归分析Tab. 3 Logistic regression analysis of SHOX2, RASSF1A methylation and lung adenocarcinoma status

4 SHOX2、RASSF1A 甲基化在肺腺癌病情诊断中的效能分析

以肺腺癌病情诊断结果为自变量，以SHOX2、RASSF1A 甲基化表达水平为因变量，绘制ROC 曲线（图3）。分析结果显示，SHOX2、RASSF1A甲基化联合预测肺腺癌病情结果的AUC（0.821，95%CI:0.727～0.915）最大，敏感度、特异性分别为87.5%、97.5%（表4）。

图3 SHOX2、RASSF1A 和两者组合甲基化与肺腺癌病情诊断价值的Roc 曲线Fig.3 Roc curve of SHOX2, RASSF1A, and their combination methylation in the diagno‐sis of lung adenocarcinoma

表4 SHOX2、RASSF1A 甲基化在肺腺癌病情诊断中的效能分析Tab. 4 Effectiveness analysis of SHOX2 and RASSF1A methylation in the diagnosis of lung adenocarcinoma

5 比较两组的甲基化结果与细胞学诊断结果

以SHOX2、RASSF1A 基因甲基化，其中一项或两项阳性可判断总甲基化为阳性，细胞学则以有无肿瘤细胞为诊断结果，设定其见肿瘤细胞为阳性，未见肿瘤细胞为阴性；计算两组总甲基化结果与细胞学诊断符合率；结果显示，观察组中细胞学诊断结果与总甲基化结果的符合率（80%），对照组中细胞学诊断结果与总甲基化结果的诊断符合率（72.5%）（表5）。

表5 两组总甲基化结果与细胞学诊断符合率Tab. 5 Compliance rate between total methylation results and cytological diagnosis in two groups

讨 论

目前肺腺癌的具体病因尚未明确，早发现是提高存活率的基础，低剂量胸部计算机断层扫描（LDCT）筛查可早期发现肺癌，但LDCT 特异性较差，影像学检测到的肺小结节中，多为良性结节，鉴于病理学是诊断肺腺癌的金标准，影像学结果往往易滞后、误诊；而开发高效、高敏感性、高特异性的检测方法以提高肺腺癌的诊断率及准确率是非常有必要的。DNA 甲基化是一种相对稳定的表观遗传改变，经常发生在肿瘤发生的早期阶段。较早期的研究已发现肺癌患者血浆中DNA 甲基化甲程度明显高于良性肺结节患者[14]，但高甲基化也常常会发生在其他多种肿瘤如头颈部鳞状细胞癌、肾细胞癌和结肠直肠癌的血浆中[24]，因此肺穿刺活检标本、支气管肺泡灌洗液、胸水标本的基因甲基化检查更有助于肺癌的诊断。胸水标本取样不仅操作简单、患者接受度高，基层医院也可以进行，更重要的是还可以作为肺腺癌患者治疗后随访复查的连续性检查手段。本研究数据显示，观察组可疑肺腺癌患者胸水SHOX2、RASSF1A 基因甲基化程度高于对照组，是肺腺癌的危险因素，与既往肺穿刺活检和支气管肺泡灌洗液结果基本一致[17,20]，说明可疑肺腺癌患者胸水细胞学标本SHOX2、RASSF1A 基因甲基化检查也可为肺腺癌的临床诊断及病情预测提供重要参考。

既往多个研究显示SHOX2、RASSF1A基因甲基化肺癌诊断中特异性均高于90%，甚至接近100%，但在不同肺癌病理类型中敏感性有差异，其中肺腺癌敏感性较小细胞肺癌、肺鳞癌低，只有68.8～69.6%（支气管肺泡灌洗液）和77.78%（肺穿刺石蜡标本）[23,24,26]。本研究利用胸水标本检测，在病情预测诊断方面，SHOX2、RASSF1A 基因甲基化表达水平变化可能与肺腺癌的病情发展有密切联系；高敏感度及特异性原因可能与检测标本取材方式以及细胞完整度有关。肺泡灌洗液在冲刷过程中可能令异型细胞破坏，导致离心后DNA 含量降低；而肺穿刺活检小标本受更多因素影响，如病灶的大小和位置、操作者技术水平、患者配合度等等。另一方面，本研究观察组总甲基化结果与细胞学诊断结果符合率80%，高于国内文献66.67%[27]，原因可能是肺腺癌异质性较大，统计结果容易受样本细胞含量影响。胸腔积液穿刺术属于基础操作，能得到更均质化的细胞标本，这一系列可侧面提示胸水SHOX2、RASSF1A基因甲基化检测作为有效补充手段可行性较高。

对于细胞学结果与总甲基化结果不相符的患者，临床也应高度重视；如果是细胞学诊断结果为阴性而总甲基化结果为阳性的患者，则需要提前预警和密切随访，尤其是病情较为复杂或不明显的情况，可考虑穿刺活检进行组织病理学检查以免漏诊或误诊；细胞学诊断结果为阳性而总甲基化结果为阴性的患者，可多次行甲基化检查，以排除假阴性可能。

尽管靶向治疗和免疫治疗方面已取得进展，但化疗仍为肺癌治疗最有效的方法。有研究表示，大多数化疗药物对基因甲基化有促进作用，RASSF1A 基因是具有预测化疗价值的的一项有利指标[21]；在肺腺癌中，SHOX2 基因高表达或低甲基化提示患者易复发、分化程度低、预后差[22]。 SHOX2、RASSF1A两基因联合检测，可以帮助临床更精准及时地了解疗效，更早发现疾病预后发展情况，尽早调整治疗方案。

本研究当前存在一定的局限性。首先，研究样本数量相对较小，研究结论存在一定误差，还需更多患者的研究数据来验证、优化结果；其次，未对不同类型的肺腺癌患者进一步分组对比，且尚未证实胸水细胞学标本SHOX2、RASSF1A 甲基化在不同类型肺腺癌预测诊断中的广泛效力；最后，本研究未对患者疾病进行后续跟踪随访。

综上所述，SHOX2、RASSF1A 甲基化在肺腺癌胸水中呈高表达，可为肺腺癌的临床诊断及病情预测提供重要参考，也作为细胞学病理诊断上的补充，提高早期肺腺癌诊断的准确率。SHOX2、RASSF1A基因甲基化联合检测可作为一项快捷、有效的新兴无创伤性辅助检测指标，可在各级医院中广泛使用。