氧化应激与糖尿病性心肌病的发生发展

汤嘉雨，徐政倩，杨君婧，张小芬，杜来玲

（浙江树人学院树兰国际医学院，浙江省污染暴露与健康干预重点实验室，杭州 310015）

流行病学调查结果表明，中国大陆糖尿病成年患者人数预估达到了1.298 亿人，其中男性0.704亿，女性0.594 亿[1]。而中国人民死亡原因中目前占据首位的疾病是心血管疾病，城市为43.81 % ，农村为46.66 % 。慢性病的前瞻研究表明糖尿病明显增加了患心脏病风险。其中，糖尿病性心肌病（diabetic cardiomyopathy, DCM)是糖尿病患者的主要并发症之一，也是糖尿病患者死亡的主要原因[2]。氧化应激是超过细胞抗氧化能力的活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平升高，使活性氧和抗氧化防御机制失衡导致的[3]，其在糖尿病并发症（包括微血管和心血管病）的发展中起着关键作用[4]。研究发现氧化应激可加速心血管胰岛素抵抗、糖尿病性心肌病和心力衰竭[3]。氧化应激能够促进转化生长因子‐β（TGF‐β）的表达，活化的TGF‐β 使正常的成纤维细胞转化成肌成纤维细胞，进而导致心肌纤维化[5,6]。本文就氧化应激对DCM 的影响及其作用机制进行归纳综述。

1 糖尿病性心肌病

欧洲心脏病学会（European Society of Cardiolo‐gy, ESC）在2008 年发表了关于心肌病分类的声明，在声明中其将心肌病定义为排除高血压、先天性心脏病、冠状动脉疾病和瓣膜病的心肌功能和结构异常，是心肌疾病的一种[7]。DCM 这一概念在1974 年被Hamby 等[8]人首次提出，糖尿病患者的高血糖症与高胰岛素血症致使毛细血管损伤、心肌纤维化、心肌肥大并伴有线粒体异常和氧化应激增加等[9]，这符合心肌病的判断标准。DCM（这种不符合冠心病、高血压以及其他心脏病变的心肌疾病）最终可以发展为心律失常、心力衰竭和心源性休克，严重时甚至可以发生猝死。有研究发现，糖尿病女性与男性患者发生心力衰竭的风险分别提高了5 倍与2.4倍[10]。

虽然糖尿病性心肌病患者机体内发现了一些和扩张型心肌病相似的病理改变，如心肌内微血管异常、心肌细胞肥大、弥漫性心肌纤维化等，但其与限制性心肌病更加相似，限制性心肌病患者在左心室无扩张甚至收缩的情况下，左心室壁增厚，导致左心室充盈压升高。患者一般不会从限制性心肌病演变到扩张性心肌病[11]，因为限制性心肌病和扩张性心肌病分别反映不同的病理生理机制[12,13]。扩张性心肌病的左心室扩张，主要见于长期存在的I 型糖尿病患者；而限制性心肌病的左心室虽室壁增厚但其大小几乎不变或更甚者较小[14]，常见于肥胖的II 型糖尿病患者，其患病率是I 型糖尿病的20 倍以上[15]。

病理性心肌肥厚的显微结构特征是心肌细胞肥大、心肌纤维化和心肌细胞凋亡[16]。其中，心肌纤维化在DCM 的心脏结构重建中起着至关重要的作用，有助于左心室功能的改变和舒张功能障碍。糖尿病心脏的结构和功能改变是由TGF‐β、血栓反应蛋白‐1（TSP‐1）及相关基因等的表达增加，进而增加间质和血管周围胶原沉积加重心肌纤维化引起的[17]。糖尿病性心肌病在早期阶段为无症状的亚临床期，其特征是心脏结构和心功能异常，包括左心室肥厚与心肌纤维化、亚临床舒张功能障碍等；在有临床症状阶段，可发展为伴有射血分数保留的心力衰竭（HFpEF，射血分数≥50%），更甚者出现射血分数降低的心力衰竭（HFrEF，射血分数≤40%），此时心脏存在明显的收缩期功能障碍[18]。

2 氧化应激与糖尿病性心肌病

糖尿病会导致慢性炎症和氧化应激增加[19,20]。氧化应激是由自由基的形成和清除之间的不平衡引起的一种现象[21]。最有效的自由基来源于分子氧，大约95% 的氧气作为能量被消耗并最终变成水；然而剩下的5% 会产生代谢产物，称为ROS，包括超氧阴离子（O2•−）、过氧化氢（H2O2）、单线态氧（1O2）和羟基自由基（•OH），ROS 与未配对的电子形成分子和原子，称为自由基[22]。内源性ROS 主要产生于线粒体，线粒体中电子泄漏和O2•−的形成对糖尿病性心肌病非常重要。细胞的代谢越活跃，线粒体越多，心脏是机体中代谢最活跃、线粒体密度最高的器官。线粒体呼吸链传递来的4 个电子和1 个氧分子在线粒体细胞色素氧化酶上结合还原，并与4个氢离子作用生成2 个分子水，在这个过程当中，线粒体的电子传递链会漏出0.2%～2% 的电子并且与氧发生反应，在氧化磷酸化过程中产生O2•−[23]。在这一过程中，只有少数氧接受电子转化为ROS，如O2•−。

然而，在糖尿病细胞中血糖病理性提高会导致线粒体的电子传递链异常，大量产生ROS[24]，从而引发氧化应激。这主要涉及4 种分子机制：增强己糖胺生物合成途径（hexosamine biosynthetic pathway,HBP）与多元醇途径（polyol pathway），激活蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）和增加晚期糖基化终产物（advanced glycation end‐products, AGEs）的形成。线粒体超氧化物过量产生可以导致DNA 链断裂，进而激活作为DNA 损伤感受器的多聚ADP 核糖聚合酶（PARP）[25]。PARP 会抑制糖尿病患者体内高血糖细胞中的关键糖酵解酶——3‐磷酸甘油醛脱 氢 酶（glyceraldehyde‐3‐phosphate dehydrogenase,GAPDH）的活性，导致GAPDH 上游的糖酵解代谢产物增多，激活并进入以上4 条通路[4]。由糖尿病引发的4 条通路和线粒体过量产生ROS 的也会进一步加剧氧化应激（图1）。

图1 氧化应激在糖尿病性心肌病发展中的作用。高血糖诱导线粒体过量产生ROS，如O2•− 和 H2O2，由此通过抑制GAPDH 导致己糖胺生物合成途径流量增和多元醇途径流量增加，PKC亚型活化和AGEs形成增加。这些通路本身是额外ROS 和氧化应激的来源。O2•−：超氧阴离子自由基；PARP：聚ADP 核糖聚合酶；GAPDH：3‐磷酸甘油醛脱氢酶；AGEs：晚期糖基化终产物。Fig.1 The role of oxidative stress in the development of diabetic car‐diomyopathy. Hyperglycemia induces mitochondrial overproduction of ROS, such as O2•− and H2O2, which induces an increased HBP flux,an increased polyol pathway flux, activation of PKC isoforms, and in‐creased AGEs formation via inhibition of GAPDH. These pathways are themselves a source of additional ROS and oxidative stress. O2•−: super‐oxide anion radicals; PARP: poly(ADP‐ribose) polymerase; GAPDH:glyceraldehyde 3‐phosphate dehydrogenase; AGEs: advanced glycation end‐products.

细胞内高血糖、心肌细胞脂肪氧化和脂毒性增加都导致线粒体过量产生ROS。糖尿病患者的心脏特征包括脂肪酸氧化增加和葡萄糖利用率降低，从而引发心脏中血脂过量累积，导致心肌脂毒性，这可能是触发心脏氧化损伤和慢性炎症的因素[26]。脂肪酸氧化会直接影响糖酵解和丙酮酸脱氢酶的活性[27]。糖原合成酶激酶‐3β（GSK‐3β）是葡萄糖在心脏代谢的关键酶。脂肪酸氧化增加和特异性胰岛素抵抗引起糖尿病心脏和大血管系统中线粒体过量产生活性氧，而活性氧会导致胰岛素信号传导受损。糖尿病患者心肌细胞中的胰岛素信号传导受损会抑制蛋白激酶β（Akt），导致GSK‐3β 磷酸化失活[28]，从而改变能量代谢。心脏脂毒性是指心脏中脂质不断被摄取氧化，并且伴有线粒体功能障碍。心肌脂肪酸摄取增加导致线粒体结构重构，使其最小直径显著减小，这与分离线粒体中棕榈酰肉碱氧化增加和活性氧产生增加有关[29]。游离脂肪酸诱导的活性氧过量产生，也会导致活化PKC、激活己糖胺途径和多元醇途径、形成AGEs[30]。

蛋白质的折叠和内质网应激也与氧化应激有关系。因为蛋白质的折叠需要在氧化还原稳态的环境中进行，所以氧化应激可能会破坏蛋白质折叠机制，导致蛋白质折叠错误的出现[31]。而心脏内质网的功能也会被炎症和脂毒性所破坏，引发内质网应激，导致未折叠蛋白反应（UPR）[32,33]。内质网未折叠蛋白反应超负荷可导致心肌细胞损伤凋亡与心脏功能异常[34]。有研究表明在2 型糖尿病中内质网未折叠蛋白反应（UPRER）可通过激活PERK 通路调控线粒体未折叠蛋白反应（UPRmt），影响细胞存活[35]。线粒体相关的内质网膜(MAMs)是由线粒体和内质网之间的物理接触而形成的一个独特的区域，并介导细胞器的交流。在高糖条件下，MAMs 的距离和组成的改变会导致细胞内信号转导异常，从而影响其生理功能，导致线粒体功能障碍和异常凋亡[36]。

3 糖尿病性心肌病的分子机制

高糖导致糖尿病并发症的机制主要有4 种假说[4,37]，即增加葡萄糖进入己糖胺生物合成途径进行代谢的流量，增加葡萄糖代谢的多元醇途径，激活蛋白激酶C 信号通路和增加AGEs 的形成并激活其受体RAGE 信号通路。如图1 所示，这4 条通路不仅直接导致糖尿病性心肌病，而它们本身也会加剧氧化应激。

3.1 己糖胺生物合成途径

葡萄糖进入细胞后，被磷酸化为葡萄糖‐6‐磷酸，并代谢为果糖‐6‐磷酸，其中一部分被允许进入己糖胺生物合成途径（hexosamine biosynthesis path‐way, HBP）。在糖酵解的果糖‐6‐磷酸步骤中，HBP通常只是葡萄糖代谢的次要替代途径；但当外源性葡萄糖输入心肌细胞的量超过了其通过糖酵解和丙酮酸氧化代谢的能力时，HBP 通量会增加[38]。HBP的葡萄糖代谢使糖基分子β‐N‐乙酰氨基葡萄糖（O‐linked β‐N‐acetylglucosamine, O‐GlcNAc）连接到蛋白的丝氨酸或苏氨酸残基上形成O‐GlcNAc修饰，影响其生物活性（类似于磷酸化），O‐GlcNAc 修饰广泛存在，对细胞内的许多信号通路具有调节作用。在正常生理情况下，HBP/O‐GlcNAc机制的短暂激活是提高细胞存活的一种适应性、保护性的手段；但在高血糖等病理情况下，HBP/O‐GlcNAc异常增加在糖尿病并发症中起重要作用[39]。在心肌细胞中，高血糖、氧化应激和导致心肌细胞凋亡的HBP 之间的联系已被证实[40]。高血糖导致在心肌中发生过量脂肪酸氧化，糖酵解中间体果糖‐6‐磷酸因浓度提高被转移到HBP 中，可导致蛋白质功能和基因表达的变化。除此之外，氧化应激也可通过抑制糖酵解的限速酶GAPD 来增加HBP 通量，诱发心肌细胞凋亡，从而导致DCM 的发病。在高葡萄糖水平的肌细胞中发现肌质网钙离子ATP 酶2a（sarcoplasmic reticulum calcium ion ATPase 2a, SERCA2a）蛋白质和mRNA表达水平降低，核蛋白O‐GlcNAc 增加，SERCA2a启动子活性降低[41]。谷胱甘肽（glutathione, GSH）作为机体内一种重要的抗氧化剂，能够清除掉人体内的自由基，具有抗氧化作用，GSH 的消耗会引起氧化应激从而来激活HBP[42]。

3.2 多元醇途径

在糖尿病患者中，多元醇途径非常活跃，消耗体内约30% 的葡萄糖[43]。多元醇途径经醛糖还原酶（aldose reductase, AR）、山梨醇脱氢酶（sorbitol dehydrogenase, SDH）前后两步代谢将葡萄糖转化为果糖。在这一途径中，AR 利用还原型辅酶Ⅱ（nico‐tinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH）作为电子供体将葡萄糖转移到山梨醇中，然后山梨醇被SDH 氧化为果糖，辅助因子NAD+转化为NADH[44]。多元醇途径导致ROS 过量产生，因为AR 过度利用NADPH 导致GSH 无法再生，从而降低了整体抗氧化能力，导致或加剧细胞内氧化应激；同样，SDH会导致NADH 的积累，而NADH 是一种产生ROS的NADH 氧化酶的底物[45]。研究人员使用新型AR抑制剂AT‐001 治疗28 天后，可以显著降低糖尿病患者血液中的山梨醇水平[46]。目前AT‐001 正在被进行一项随机、双盲、安慰剂对照、全球3 期临床研究，旨在发现这种具有更高特异性的AR 抑制剂对有高风险进展为心力衰竭的DCM 患者的疗效[47]。

3.3 蛋白激酶C

PKC 是一组蛋白激酶，可以磷酸化其他蛋白并影响其功能，如信号转导功能、细胞存活和死亡等。PKC 异构体已被证明在糖尿病和许多高血糖并发症（尤其动脉粥样硬化和DCM）中发挥重要作用[48‐50]。在心肌组织中，PKCα 和PKCβ2 是主要的PKC亚型[51]。通过失活PKCα 信号通路减轻氧化应激和炎症反应，山楂叶黄酮（Hawthorn leaf flavonoids,HLF）对大鼠糖尿病性心肌病有保护作用[50]。氧化应激诱导PKCβ 激活，促进p66Shc磷酸化，使其被肽基脯氨酰基顺反异构酶（Pin‐1）识别并从细胞质转移到线粒体，诱导线粒体H2O2产生，从而进一步增加细胞内H2O2水平，H2O2、PKCβ、p66Shc三者形成循环，在一种自触发的控制回路中维持或提高PKCβ 的激活[52]。PKCβ2/p66Shc氧化应激通路在糖尿病性心肌中过度激活，引发心肌细胞肥大、纤维化以及心脏收缩功能下降[53]。高糖诱导PKCβ2 的过度激活可通过损害小泡蛋白‐3（caveolin‐3）的表达和Akt/eNOS 信号通路导致心脏舒张功能障碍[54]。选择性PKCβ 抑制剂ruboxistaurin（RBX）和抗氧化剂N‐乙酰半胱氨酸（N‐acetyl‐cysteine, NAC），可以抑制PKCβ2 活化，减少氧化应激，缓解糖尿病的心肌肥大和功能障碍[55]。

3.4 晚期糖基化终产物

非酶糖基化（non‐enzymatic glycosylation, NEG）是发生在高尔基体和内质网中，还原糖与蛋白质、脂质或核酸之间的非酶促过程。NEG 会改变抗氧化酶的结构，从而使其失去抗氧化的功能，无法清除自由基，提高糖尿病患者的氧化应激[56]。美拉德反应中，还原糖类羰基物质和蛋白质氨基化合物发生反应形成席夫碱，再通过阿马道里重排(Amadori rearrangement）反应，形成酮胺。席夫碱和酮胺是可逆的反应产物，但和氨基酸残基会产生不可逆反应，形成AGEs。因为大多数AGEs 是由氧化和糖基化形成的，所以被称为糖氧化产物。在高血糖环境下，AGEs 的形成比在生理条件下大幅度提高。AGEs 大量存在于糖尿病患者的心脏中，因此可能是一种导致糖尿病性心肌病的主要源由[57]。RAGE是一类模式识别受体，能特异性识别和结合AGEs而且产生对应生物学效应的免疫球蛋白超家族受体（IgSFR）[58]。内皮祖细胞（EPCs）中的RAGE 和AGEs 反应增加了NADPH 氧化酶的活性，NADPH氧化酶将电子从NADPH 转移到分子氧并产生活性氧，氧化应激、AGEs 和RAGE 之间的反应激活JNK信号通路，导致心脏细胞凋亡，而使用siRNA 阻断RAGE 可以阻止JNK 的活化[59]。

4 总结与展望

迄今为止，氧化应激一直被认为在DCM 中起着关键作用。由于心脏是人体代谢最活跃的器官，且其线粒体含量与其他组织相比也是最高的，所以心脏极其容易过量产生ROS 并受到氧化应激的损伤。高血糖致使线粒体过量产生ROS，进而促进心脏中的氧化应激。氧化应激致使HBP 与多元醇通路通量增加、PKC 活化、AGEs 形成增加以及RAGE 的活化。这些代谢通路的异常增强又导致ROS 过量产生，从而形成恶性循环，导致氧化应激永久化。氧化应激的增加会导致细胞线粒体损伤、心肌纤维化与肥厚以及心脏功能障碍。因此，抑制ROS 的产生和清除心肌细胞中过多的ROS 可以保护心肌免受高糖介导的氧化损伤。在对糖尿病性心肌病的动物研究中，发现提高原发性抗氧化酶的表达可以减少心肌病理学改变并且改善心脏功能。钠糖共转运蛋白2（SGLT2）抑制剂是目前治疗糖尿病相关心力衰竭最有效的方法之一，其被证实可以对抗氧化应激[60]，但其具体药理活性和作用机制，以及对DCM 的病理变化影响，都需要进一步研究[61]。未来若一些主要抗氧化酶的基因转移治疗能够成功逆转DCM，这些实验将最终证明氧化应激是DCM 的关键因素，并为临床预防及治疗DCM 提供新的治疗方法。