核固红、中性红和伊红复染液在含铁血黄素染色中的应用比较

林婷，吴在增，康福，温虹，周冬梅

（福建医科大学肿瘤临床医学院，福建省肿瘤医院，福州 350012）

普鲁士蓝反应（Perls）是经典的组织化学反应，可用于识别3价铁离子。血红蛋白被巨噬细胞吞噬后经溶酶体降解释放出的3 价铁离子与蛋白结合后形成金黄色的颗粒，称含铁血黄素。含铁血黄素染色是病理诊断技术中常用到的方法，应用Perls 反应和复染液衬染，可以显示和证明组织内3 价铁离子的存在及各种出血性病变。在实际工作中由于缺乏统一的指导意见，不同的实验室采用不同的复染液进行染色，导致染色结果参差，不利于诊断。本实验对3 种常用的复染液, 核固红、中性红和伊红复染液在含铁血黄素染色中的染色情况进行对比，分析各自的特点，以期为获得理想的实验结果提供参考。

材料与方法

1 材料

收集福建省肿瘤医院病理科标本组织，均已明确含铁血黄素阳性，其中，肝脏组织、肺组织、胃组织、乳腺组织各1 例。含铁血黄素染色试剂盒购自福州迈新公司，主要包括亚铁氰化钾染液，促染剂。核固红（上海化学试剂厂），中性红（上海试剂三厂），硫酸铝钾（永大试剂），伊红（上海国药）。

2 方法

2.1 试剂配制

根据病理技术相关专业书籍中的介绍[1]，选用3 种复染液进行实验，包括0.1%核固红、0.5%中性红、1%伊红。0.1%核固红溶液：5 g 硫酸铝钾溶于100 mL 蒸馏水中配制5%硫酸铝钾水溶液，再加入0.1 g 核固红，加温至充分溶解后冷却至室温使用。0.5%中性红：称取1 g 中性红粉剂，加入200 mL 蒸馏水中，搅拌至充分溶解，室温放置备用。1%伊红：将1 g 伊红加入到100 mL 的95%乙醇中充分溶解，加入1‐2 滴冰醋酸后室温保存。

2.2 染色方法

常规脱水、石蜡包埋的组织块，每例标本切5片，厚度为4μm；常规脱蜡至水，并用蒸馏水充分冲洗；将亚铁氰化钾染液和促染剂等量混合，现配现用；滴加配好的亚铁氰化钾和促染剂混合染液，充分覆盖组织并孵育15 min；蒸馏水冲洗3 遍；分别用0.1%核固红、0.5%中性红、1%伊红孵育切片10 min；核固红与中性红染色的切片经蒸馏水冲洗后风干直接封片，伊红染色的切片放入梯度酒精脱水（每一级各10 s），二甲苯透明，中性树胶封片。

结 果

以不同复染液染色后观察切片染色效果，在4种组织中观察到的染色效果一致：核固红组细胞核呈淡红色，含铁血黄素呈深蓝色，二者颜色对比较强；中性红组颜色艳丽，定位细胞核，普鲁士蓝呈蓝灰色，颜色对比好；伊红组颜色鲜艳，定位细胞质，HE 形态可见，对比度较弱。图1 所示为肺组织切片染色效果。

图1 3 种复染液在肺组织上的染色效果比较。A，0.1%核固红溶液；B，0.5%中性红；C，1%伊红。比例尺，100 µmFig. 1 Comparison of the staining effects of three counterstaining solutions on lung tissue. A, 0.1% nuclear fast red; B, 0.5% neutral red; C, 1% eosin.Scale bar, 100 µm

讨 论

常规HE 切片在镜下观察到棕色色素但尚不能明确其来源时，可行含铁血黄素染色进行鉴别[2]。含铁血黄素染色多用于显示组织中铁离子的存在，对贫血及出血性疾病的诊断有益，但对肿瘤诊疗的指导作用不大。近年来随着对铁代谢研究的深入，越来越多的学者认为铁代谢及铁死亡与许多肿瘤的发生发展及预后相关，检测铁的表达在肿瘤诊断和治疗中的作用逐渐显露。Kim 等[3]提出铁死亡是肿瘤微环境中病理性激活的中性粒细胞的一种独特且可靶向的免疫抑制机制，可以通过药理学调节来限制肿瘤进展。Behrouz Hassannia 等[4]认为可通过靶向铁死亡治疗癌症。陈菲等[5]将普鲁士蓝与油红O套染建立铁死亡模型以研究铁死亡中铁离子与脂质的关系。因此对含铁血黄素染色的方法进行统一规范，指导病理技师在日常工作及科学研究中更加高效制出精良的切片，就有了更大的意义。

本研究中，核固红复染细胞核定位清晰，颜色淡红，与普鲁士蓝对比度好。研究选用李莉等[6]推荐的配置方法，用0.5%硫酸铝钾水溶液配制0.1%核固红，切片染色效果好，核固红用量较少，配制成本较低，硫酸铝钾为病理科常用试剂，用于苏木素染液配制，获取方便。中性红复染使细胞核呈红色，颜色亮丽，普鲁士蓝呈蓝灰色，对比明显。中性红使用蒸馏水配制，操作简单。伊红复染可显示细胞质、红细胞与肌肉，无法显示细胞核，与普鲁士蓝对比较弱，复染后需经酒精分化，步骤较为繁琐。综合比较三种复染液，推荐使用0.1%核固红进行复染，染色对比效果更佳。

普鲁士蓝反应是利用酸化的亚铁氰化钾与三价铁反应生成不溶解的蓝色化合物，反应式为 4FeCl3+3K4Fe(CN)6→Fe4［Fe(CN)6］3+12KCl。实验中应注意等比例混合亚铁氰化钾与盐酸水溶液，染色过程避免使用金属铁制品和容器，使用蒸馏水冲洗，防止自来水中的铁离子与组织中的钙盐结合产生假阳性结果。需注意的是，染液的温度和反应的温度都会影响反应的进行及染色结果的观察。可以利用微波加热，缩短铁氰化钾与盐酸的反应时间，加快染色速度，但也有实验室认为反应过程中加热会导致切片和组织上出现细小的蓝色沉淀[1]，不利于诊断。因此，染色前准备中染液的复温就显得格外重要。笔者在日常工作中发现，核固红的溶解度较差，配制后置于4℃冰箱保存，使用前若仅置于室温复温则不易上色，延长染色时间则制片效率降低，且染色效果较差。于是笔者将核固红染液置于4℃冰箱保存1 周后分别在室温和37℃温箱进行复温比较，发现同样复温1h 的情况下，37℃温箱复温的染色效果较室温复温染色效果好，颜色较为艳丽，对比度好。推荐在实验前将核固红染液置于37℃温箱复温1h，可提高核固红着色效果。

综上所述，在相同实验条件下，0.1%核固红染液复染含铁血黄素，颜色对比度较好，效果更佳。