乳杆菌体外降解胆固醇特性研究

刘剑桥，吴酉芝，冉军舰，赵瑞香，梁新红，段旭

（1.河南科技学院食品学院，河南新乡 453003；2.上海中侨职业技术大学食品药品学院，上海金山 201514）

0 引言

胆固醇又叫胆甾醇，是一种环戊烷多氢菲的衍生物[1]，最早在18世纪发现于胆石中[2]。人体中胆固醇的来源有两种，一种是由人体内合成，另一种从食物中获取而来。近年来，随着人们生活水平的提高，摄入动物类食品每年都以惊人的速率增加，体内胆固醇过多[3]，从而产生各种疾病，如造成动脉硬化，引起心血管疾病。

有研究表明，降低血脂中总胆固醇的含量能够减少患心血管疾病的风险[4-5]由于药物治疗会给人体造成损伤，手术治疗风险大[6]。近年来大量的实验及临床研究表明，乳杆菌及相关的制品具有降胆固醇的能力[7]。研究者从酸奶[8-9]、发酵芥菜[10]、传统发酵乳[11]、新生儿粪便[12]、发酵豆酱[13]等分离的乳酸菌去胆固醇效果很好；实验室保存的菌种[14]也有较高的去除胆固醇的能力，LEE等[15]研究了61株益生菌均有降解胆固醇的能力，其中有20株益生菌降胆固醇的能力达到了27%以上，其中植物乳杆菌MA2降胆固醇能力最高达到了50%以上。

本文研究了嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌体外降解胆固醇的能力、耐酸性、疏水性、自凝聚力、耐胆盐能力、胆盐水解酶的活性和不同金属离子的不同浓度对胆固醇的降解率以及降解能力，以期为乳杆菌体外降解胆固醇提供理论基础和试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 菌株

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum zrx03）、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus zrx02)、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus zxr01）保藏于河南科技学院食品学院食品生物技术实验室。

1.1.2 试剂与仪器设备

主要试剂：牛胆盐、胆固醇、牛磺脱氧胆酸钠，合肥博美生物科技有限责任公司；硫代乙醇酸钠，上海麦克林生化科技有限公司；氯化钙，天津市科密欧化学试剂有限公司；硫酸铁铵，天津市德恩化学试剂有限公司；以上试剂均为分析纯。

M RS培养基：胰蛋白胨10 g，无水葡萄糖20 g，无水乙酸钠5 g，柠檬酸氢二铵2 g，硫酸锰0.25 g，磷酸氢二钾2 g，硫酸镁0.58 g，牛肉浸粉10 g，酵母膏5 g，吐温80 1 mL，p H 6.2～6.4，121℃灭菌30 min。

胆固醇溶液[16]：准确称量1 g胆固醇于100 mL容量瓶中，用无水乙醇定容至100 mL，在无菌条件下用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。

MRS-CHOL液体培养基[17]：在MRS培养基中加入0.3%的牛胆盐，灭菌后加入胆固醇溶液，使培养基中的胆固醇溶液浓度为0.1 g/L。

仪器与设备：ZHWY-211恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；GeneScience E200厌氧培养箱，重庆江雪科技有限公司；3-30 K台式高速离心机，德国Sigma公司；SW-CJ-1D(经济型)单人单面垂直净化工作台，苏州智净净化设备有限公司；G9800A酶标仪，美国Thermol公司；Model PHS-3C型p H计，上海盛磁仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的活化以及培养

取冻藏于-80℃冰箱里的3株乳杆菌划线培养，挑培养皿中的单菌落于MRS液体培养基中37℃培养16 h，按照体积分数1%的接种量于MRS培养基中培养，备用。

1.2.2 胆固醇标准曲线

参考GB/T 5009.128-2003《食品中胆固醇的测定》。

1.2.3 3株乳杆菌的胆固醇降解率

取活化两次后的菌液按照5%接种于MRSCHOL液体培养基中培养24 h，取MRS-CHOL培养物0.2 mL于10 mL离心管中，向离心管中加入4.8 mL无水乙醇（沿离心管壁缓缓加入）。静置15 min后，9 500 r/min离心10 min。吸取上清液2 m L（注意缓慢吸取）于试管中，再加入2 mL铁钒显色剂溶液，用移液枪缓慢吹打均匀，冷却到室温后，在15～90 min内，用酶标仪测其在560 nm下测吸光值，以2 mL无水乙醇加入2 mL铁钒溶液作为空白调零，以不接菌种的MRS-CHOL的液体培养基作为对照，做3组平行试验。对照组胆固醇浓度CA减去测定的胆固醇浓度CB即可得到3株乳酸菌降解胆固醇的浓度，由此可得到3株乳酸菌胆固醇降解率的公式：

1.2.4 3株乳杆菌的耐酸性

将配制好的MRS溶液p H调至6.0,5.0,4.0,3.0，将活化两次后的菌液按照体积分数为5%接入上述pH值的MRS培养基中，37℃培养3 h后，以未接种的MRS培养基作为空白调零，测3株乳杆菌在不同p H的在600 nm处的吸光值，以p H=6.0的作为对照。菌株的耐酸性：

式中：A1为实验组的OD600 nm；A2为对照组的OD600 nm。

1.2.5 3株乳杆菌的疏水性

将活化两次后的菌株按照体积分数为5%接入MRS培养基中37℃培养18 h。取适量菌液于50 mL离心管中在4℃，10 000 r/min离心10 min收集菌体，弃上清，用p H=6.2的PBS缓冲液洗涤菌体2次，在用PBS缓冲液重新悬浮菌沉淀。用PBS缓冲液调整菌体浓度（以PBS缓冲液为空白对照调零），使其在600 nm处吸光度为1.00±0.05，并测其准确OD值。将菌悬液中加入三氯甲烷（4∶1，体积比），在旋涡混合仪上涡旋30 s，室温下静置10 min分层。测菌体在600 nm处的吸光度。乳酸菌疏水能力的计算：

式中：A1是与三氯甲烷混匀前菌液OD 600nm；A2是与三氯甲烷混匀后菌液OD600nm。

1.2.6 3株乳杆菌的自凝聚力

菌株按照5%(体积比)接种于MRS培养基，培养18 h。取适量菌液于50 mL离心管中，在4℃，10 000 r/min离心10 min后弃掉上清，用p H=6.2的PBS缓冲液洗涤两次，将菌液沉淀重悬。用PBS缓冲液调整菌体浓度，使其在600 nm波长下的OD值为1.00±0.05（以p H=6.2的PBS缓冲液为空白对照调零），并测其准确OD值，记为A1。取4 m L调整浓度后的菌液于10 mL离心管中，将离心管置于生化培养箱中37℃培养，测3株乳杆菌静置1 h，24 h上清液在600 nm的吸光值，记为A2。

1.2.7 3株乳杆菌的耐胆盐能力测定

将活化两次后的菌株按照5%的体积比接种于不加牛胆盐的MRS培养基以及加入含0.05%、0.3%牛胆盐的MRS培养基中，37℃培养24 h后，以不加胆盐的MRS培养基对照组和不加同胆盐的MRS培养基试验组，测对照组和试验组在600 nm处的吸光值（以未接菌种的MRS培养基做空白对照调零）。

式中：A1为3株乳杆菌在不加胆盐的MRS培养基600 nm处的吸光值；A2为3株乳杆菌在含不同胆盐的MRS培养基600 nm处的吸光值。

1.2.8 3株乳杆菌胆盐水解酶的测定

采用郭均[18]的方法并进行微调，在刚配制好的MRS培养基中加入0.3%的牛磺脱氧胆酸钠、0.37 g/L的氯化钙、0.2%的硫代乙醇酸钠、2%的琼脂，121℃灭菌30 min。灭过菌后倒入培养皿中，待其凝固后，将事先准备好已灭过菌的滤纸片放入培养皿中，在每个滤纸片上加入40μL活化两次后的菌液的菌液，放置在厌氧培养箱中37℃培养72 h。用不加牛磺脱氧胆酸钠的作对照。对照组无明显现象，试验组产生白色沉淀，则菌株能产生胆盐水解酶。

1.2.9 阳离子对3株乳杆菌降胆固醇的影响

1.2.9.1 阳离子氯化物的配制

准确称取氯化钠9.35 g、氯化钾11.93 g、氯化钙8.88 g、氯化镁7.60 g、氯化铝7.11 g分别溶于蒸馏水中并于100 mL容量瓶中定容至100 mL,配制成各自贮存液，使溶液中金属阳离子的当量浓度均为1.6 N（为了保证各处理组中阴离子即Cl-浓度一致，试验中采用当量浓度作为单位），0.22μm微孔滤膜过滤除菌后紫外杀菌30 min。

1.2.9.2 阳离子对乳杆菌降胆固醇的影响及降解效力的测定

将上述不同氯化物阳离子的溶液按照10%加入MRS-CHOL液体培养基中，使阳离子当量浓度为0.02、0.04、0.08、0.16 N，在将活化两次后的菌液按照5%加入其中，37℃培养24 h。测定不同浓度下的胆固醇降解率和降解效力，胆固醇降解率的计算同1.2.3。胆固醇降解效力参考王菁的方法[19]。

1.2.10 数据分析

每组试验重复3次，用Excel和Origin2019作图，所有结果按平均数±标准差。

2 结果与分析

2.1 3株乳杆菌体外胆固醇降解率

由图2可知，3株乳杆菌都有降解胆固醇的能力，但是对胆固醇的脱除能力各不相同，脱除率越高的说明体外降解胆固醇的能力越强。嗜酸乳杆菌的胆固醇降解率为28.87%、鼠李糖乳杆菌为25.61%、植物乳杆菌为20.39%。龙竣瑶等[20]从六堡茶中筛选降胆固醇菌株时，发现乳酸菌胆固醇去除率为0～30%，表明3株乳杆菌都有降解胆固醇的能力，且降解胆固醇的能力大小排序为：嗜酸乳杆菌>植物乳杆菌>鼠李糖乳杆菌。

图2 3株乳杆菌降胆固醇

2.2 3株乳杆菌的耐酸性

由图3可知，3株乳杆菌的耐酸性随着p H值的降低3株乳杆菌的生长情况下降，3株乳杆菌的耐酸性存活率因pH值不同也存在着差异。人们在食用食物后，胃液的p H值在1.8～5.0的范围内不断变化，一般认为胃液的p H值为3.0[18]。嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌在p H值为3时3株乳杆菌的都能存活，但是耐酸性存活率分别为52.77%、52.57%、59.82%，鼠李糖乳杆菌的耐酸性存活率和嗜酸乳杆菌差异不大，略低于植物乳杆菌。在相同的p H值下植物乳杆菌的生长情况要较优于嗜酸乳杆菌远优于鼠李糖乳杆菌，但是在p H值为3和4时3株乳杆菌的耐酸性存活率的差异不大，pH值为5时鼠李糖乳杆菌的耐酸性存活率要高于其它两株乳杆菌。郭心悦等[21]从金针菇分离得到的菌株4J17在p H值为3时的耐酸性存活率仅为20.00%。本试验测得3株乳杆菌在p H值为3时3株乳杆菌存活率均在50%以上，表明3株乳杆菌的耐酸性较强。

图3 3株乳杆菌的耐酸性

2.3 3株乳杆菌的的疏水性

益生菌对肠上皮细胞的黏附能力与疏水性和自凝聚力之间存在着正相关性[25-26]。

本研究以三氯甲烷为吸附剂研究了3株乳杆菌的疏水性。由图4可以看出，嗜酸乳杆菌，鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌的疏水性依次为19.88%，10.41%和13.82%。嗜酸乳杆菌的疏水性最强，鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌的疏水性较低。降初祝玛[22]等研究的乳酸菌株编号266的疏水性仅为2.3%，表明3株乳杆菌有较好的疏水性，3株乳杆菌疏水性大小为：嗜酸乳杆菌>植物乳杆菌>鼠李糖乳杆菌。

图4 3株乳杆菌的疏水性

2.4 3株乳杆菌的自凝聚力

由图5可以看出，随着时间的增加植物乳杆菌，嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的自凝聚力会提高。菌株静置1 h后3株乳杆菌的自凝聚力不是特别明显，嗜酸乳杆菌的自凝聚力为8.59%、鼠李糖乳杆菌为6.70%、植物乳杆菌为9.66%。3株乳杆菌静置24 h后，植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌的自凝聚力都超过了80%，但是鼠李糖乳杆菌的自凝聚力仅有65.47%。玛丽娜·库尔曼[23]等从传统酵素中分离出来的菌株M-16的自凝聚力不到60%，本试验测得3株乳杆菌自凝聚力均超过了60%。菌株的自凝聚力是由疏水性决定的，同时与黏附性呈正相关。所以对肠上皮细胞的黏附性强弱顺序为：嗜酸乳杆菌>植物乳杆菌>鼠李糖乳杆菌。

图5 菌株的自凝聚力

2.5 3株乳杆菌的的耐胆盐能力

由于人体的肠道内胆汁的浓度总是在时刻的变化着，但是其含量总在0.03%～0.3%的范围内变化[24]。所以本文选择了0.05%和0.3%的两个牛胆盐浓度作为菌株的检验条件。

由图6可知，在牛胆盐含量为0.05%时，植物乳杆菌的耐胆盐能力是最高的，说明在人体肠道内胆汁浓度低时，植物乳杆菌的生长情况最好。在牛胆盐含量为0.3%时，嗜酸乳杆菌的耐胆盐能力最好为28.65%，但是鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌存活率分别为27.40%和26.04%，只是略低于嗜酸乳杆菌，3株乳杆菌在人体肠道内能够生长。朱奇奇[25]等从分离出来的植物乳杆菌I4在胆盐为0.3%时，几乎没有生长，表明3株乳杆菌有较好的胆盐耐受性。

图6 3株乳杆菌在0.05%和0.3%的牛胆盐的存活率

2.6 3株乳杆菌胆盐水解酶活性的测定

胆盐水解酶能将肠道中的结合态的胆盐水解为游离胆酸和氨基酸，游离的胆酸能与胆固醇形成复合体，从而降解胆固醇。所以胆盐水解酶作为筛选胆固醇菌株的一个重要判定指标[5,7,23]。由图7可知，将滤纸片取下后，实验组与对照组相比，实验组的滤纸片下方均产生了白色沉淀而对照组没有白色沉淀，这是因为胆盐水解酶将培养皿中添加的结合态的胆盐水解为游离的胆盐，而游离的胆盐与CaCl2中的Ca2+结合形成沉淀，郭均[18]研究的干酪乳杆菌、植物乳杆菌胆盐水解酶试验产生了白色沉淀，说明3株乳杆菌均可以产生胆盐水解酶。因此说明这3株乳杆菌均有胆盐水解酶活性。

图7 3株乳杆菌的胆盐水解酶活性的测定

2.7 不同金属阳离子对乳杆菌降胆固醇的影响

生活中与人体生活息息相关的各种金属离子对乳酸菌的生长情况会因其不同种类及不同浓度有促进和抑制作用[19]。乳酸菌的生长情况会影响其对胆固醇的降解率和效果，金属离子通过影响乳酸菌的生长情况而影响对胆固醇的降解率和效果。

据研究表明Na+、K+在体外对分离纯化的胆盐水解酶有激活作用但是不明显[26]，Ca2+、Mg2+在体外对分离纯化的胆盐水解酶有激活作用较大[27]，Al3+对胆盐水解酶的活性有抑制作用[26]。

2.7.1 一价阳离子（Na+、K+）对乳杆菌降胆固醇的影响

由图8可以看出，随着Na+氯化物在MRSCHOL培养基添加浓度的升高，嗜酸乳杆菌的胆固醇的降解率先升高在降低，其降解效力先降低在升高在降低，在浓度为0.04 N时降解率及降解效力最高，而鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌则随着Na+浓度的升高胆固醇降解率以及降解效力不断降低。随着K+氯化物在MRS-CHOL培养基添加浓度的升高嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌胆固醇降解率和降解效力不断降低。

2.7.2 二价阳离子（Ca2+、Mg2+）对乳杆菌降胆固醇的影响

由图9可知，随着Ca2+、Mg2+氯化物MRS-CHOL培养基中添加浓度的升高，嗜酸乳杆菌的胆固醇降解率呈现先升高后降低，在浓度为0.02 N时胆固醇降解率最高，鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌的胆固醇降解率随着离子浓度的升高而呈现不断降低的趋势；嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌的降解效力随着离子浓度的升高呈现先升高后下降的趋势，降解效力均在浓度为0.02 N时最高。

2.7.3 三价阳离子（Al3+）对乳杆菌降胆固醇的影响

由图10可知，在添加Al3+的MRS-CHOL培养基中，嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌的降解率随着添加Al3+浓度的增加呈现不断降低的趋势，嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌接植物乳杆菌的降解效力随着浓度的增大呈现先升高后降低的趋势，在浓度为0.02 N时降解效力最高。

图1 胆固醇的标准曲线

图10 三价阳离子对乳杆菌降胆固醇的影响

3 讨论与结论

本实验研究表明3株乳杆菌均有降解胆固醇的能力，但是降解胆固醇的能力不同，嗜酸乳杆菌胆固醇降解率为28.52%明显高于鼠李糖乳杆菌的25.61%和植物乳杆菌为20.39%。通过耐酸性的研究，在p H值为3时嗜酸乳杆菌耐酸性存活率为52.77%、植物乳杆菌为52.57%略低于鼠李糖乳杆菌为59.82%。嗜酸乳杆菌的疏水性和24 h自凝聚力为19.88%、82.33%高于鼠李糖乳杆菌10.41%、65.47%和植物乳杆菌13.82%、80.96%，说明嗜酸乳杆菌对肠上皮细胞的黏附性高于鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌。在胆盐浓度为0.3%时，嗜酸乳杆菌的存活率28.65%高于鼠李糖乳杆菌的27.40%和植物乳杆菌的26.04%。3株乳杆菌都能产胆盐水解酶，说明3株乳杆菌都是产胆盐水解酶水解胆盐与胆固醇发生共沉淀降解胆固醇。

研究金属阳离子对3株乳杆菌胆固醇降解率的影响选择了Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Al3+5种金属阳离子。研究发现，在MRS-CHOL培养基中添加不同的金属阳离子，对3株乳杆菌的降解胆固醇的影响不一致，与不添加金属阳离子氯化物的相比，只有添加Na+在0.04 N时和Ca2+、Mg2+浓度为0.02 N时嗜酸乳杆菌胆固醇降解率最高，其余都是随着添加金属离子浓度增高呈现降低趋势。添加Ca2+、Mg2+、Al3+的MRSCHOL培养基中，在浓度为0.02 N时，3株乳杆菌的降解效力最高，而添加Na+的MRS-CHOL培养基中，在其浓度为0.04 N时，嗜酸乳杆菌的降解效力最高，而其它两株菌的降解效力和添加K+的MRSCHOL培养基中对3株乳杆菌的降解效力随着浓度升高而呈现一直降低的趋势。不同离子及浓度对3株乳杆菌胆固醇降解率及降解效力的不同有可能是以下几个原因：（1）生物吸附：乳酸菌的细胞壁、胞外聚合物和细胞膜通过离子交换、螯合、吸附和透过细胞壁和细胞膜的扩散吸附金属[28-29]。(2)生物转化：乳酸菌通过氧化、还原、甲基化、去甲基化等转化作用降低金属离子的毒性，从而影响对乳酸菌胆固醇去除的效果[19,30]。（3）胞外沉淀：乳酸菌通过其生理活动产生能和金属离子结合的物质,这些物质能和金属离子结合形成稳定难溶的化合物或络合物而沉淀聚集在细胞的表面[31]（4）添加的金属离子与MRS-CHOL培养基中的物质反应来影响乳杆菌胆固醇去除的效果[19]。

通过对3株乳杆菌体外降解胆固醇以及金属阳离子对3株乳杆菌胆固醇降解率及降解效力，益生特性以胆盐水解酶的研究，为人体进一步研究嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌体外降解胆固醇提供了理论参考，为3株乳杆菌在体外模拟试验中提供了依据和开发降胆固醇食品提供材料。