生牛乳中耐药芽孢杆菌的分离鉴定及四环素抗性基因tetL定位研究

曹泽钰，陆方舟，杨婧艺，余宛芸，闫娟，狄文轩，郝彦玲，翟征远

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.北京农学院食品科学与工程学院，北京 102206；3.中国农业大学营养与健康研究院，北京 100193）

0 引 言

奶牛养殖中的抗生素使用导致的食品安全问题已成为制约企业发展，影响人们健康的重大问题之一。奶牛饲养过程中使用的抗生素，可以防治疾病和促进生长，也导致了原料乳中耐药细菌累积，如部分耐药芽孢杆菌。在经过巴氏杀菌处理后，部分耐药芽孢杆菌的芽孢仍然存在于乳中，且在适宜条件下萌发而形成正常繁殖的营养体，使得巴氏杀菌乳及下游产品含有耐药芽孢杆菌。这些耐药芽孢杆菌可能不具有致病性，但其包含的耐药基因可能在乳制品生产加工过程中水平转移到其他微生物中，造成潜在的安全问题[1]。

细菌可转移质粒或染色体上的可移动元件，如IS序列、Tn转座子等可导致耐药基因的水平转移。研究发现枯草芽孢杆菌B.subtilis 168能够吸收UHT乳环境中的游离红霉素抗性质粒[2]；巴氏杀菌乳中分离的蜡样芽孢杆菌BA117的质粒带有四环素抗性基因tetL，并且能够接合转移至地衣芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌。但对生牛乳中耐热芽孢杆菌的耐药基因的定位及耐药基因可转移性的研究较少，已有研究结果多集中于抗生素敏感性普查和抗性基因的存在情况。

本研究从34个生牛乳样品中分离鉴定芽孢杆菌，并利用微量肉汤稀释法从中筛选抗生素抗性菌株；通过PCR和DNA测序确定耐药基因；进一步通过反向PCR和质粒序列测定对耐药基因进行定位。

1 材料与方法

1.1 材料、菌株、培养基及试剂

1.1.1 材料

34份生牛乳样品分别采自天津市（11）、河北省廊坊市（4）、江苏省徐州市（3）、黑龙江省大庆（1）的19个奶牛场，分4个批次采集样品，时间分别为2021年6月25日、7月8日、9月6日和9月28日。

1.1.2 菌株

质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC29213由中国食品药品检定研究院惠赠。携有tetL基因的蜡样芽孢杆菌BA117为本实验室保藏菌株。携有tetL基因的蜡样芽孢杆菌CAU 17由中国农业大学朱奎教授惠赠。接合转移受体菌副地衣芽孢杆菌BA103为本实验室保藏菌株。

1.1.3 培养基

LB培养基：酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，氯化钠10 g，去离子水定容至1 L，p H 7.0，用于质控菌株的培养；

NB培养基：牛肉浸粉5 g，胰蛋白胨10 g，氯化钠5 g，去离子水定容至1 L，p H 7.1±0.1，用于芽孢杆菌的培养。

1.1.4 试剂

牛肉浸粉、甘露醇卵黄多黏菌素琼脂培养基（MYP），北京奥博星生物技术有限责任公司；蛋白胨、酵母粉，OXOID；氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾，国药集团化学试剂有限公司；药敏检测板，上海星佰生物技术有限公司；四环素、克林霉素，中国食品药品检定研究院；红霉素、甲氧苄啶、磺胺甲恶唑，Sigma；可换膜滤器、0.45μm水系滤膜，购自宝如亿（北京）生物技术有限公司；金牌M IX，北京擎科新业生物技术有限公司；TaKaRa PCR Amplification Kit，TAKARA Bio；质粒小提试剂盒，Omega bio-tek。

1.2 主要仪器和设备

生物安全柜，Thermo Fisher Scientific；冷冻离心机,eppendorf；金属浴，天根生化科技（北京）有限公司；PCR仪和电泳仪，Bio-Rad；凝胶成像系统，UVP；酶标仪，Tecan。

1.3 实验方法

1.3.1 芽孢杆菌的分离与鉴定

依据国家标准[3]并作适当调整，为了提高芽孢杆菌的分离率，对生牛乳样品进行80℃热处理20 min后，进行分菌。进一步利用试剂盒提取芽孢杆菌基因组DNA，以基因组为模板，扩增16S rDNA片段，16S rDNA PCR引物由上海生工生物科技有限公司合成。正向引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物1492R：5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR反应程序：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，52℃退火30 s，72℃延伸40 s，30个循环；72℃延伸10 min。PCR扩增产物送至北京擎科新业生物技术有限公司进行双向测序，测序结果上传NCBI数据库（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行比对分析，确定菌株的种属。

1.3.2 芽孢杆菌的耐药性评价

依据美国临床和实验室标准协会（The Clinical&Laboratory Standards Institute,CLSI）[4]建议的微量肉汤稀释法，对66株产芽孢细菌分离株进行药敏试验，该方法注明质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC29213。共筛查分离株对11大类共12种抗生素的敏感性，分别为氨苄西林，青霉素，美罗培南，红霉素，克林霉素，环丙沙星，利福平，复方新诺明，万古霉素，四环素，氯霉素，庆大霉素。根据2016版CLSI不常见或苛养菌药敏方法M 45中芽孢杆菌耐药性判定标准进行耐药性评价。

1.3.3 携带获得性耐药基因的芽孢杆菌的质粒普查

为了确定获得性耐药基因是否存在质粒上，使用E.Z.N.A Plasmid Mini Kit试剂盒提取质粒，通过琼脂糖凝胶电泳普查获得性耐药芽孢杆菌质粒存在情况。

1.3.4 四环素耐药基因的特异性PCR检测

根据芽孢杆菌四环素耐药基因tetA、tetB、tetO、tetW、tetK、tetM和tet L的序列及参考文献，设计引物如表1所示，以四环素耐药的芽孢杆菌的基因组和质粒DNA为模板，PCR扩增四环素耐药基因，并对扩增产物进行电泳检测。

表1 四环素抗性基因扩增引物

1.3.5 反向PCR

依据冷泉港实验室（The Cold Spring Harbor Laboratory,CHL）[9]的方法，依据PCR扩增到的tet L抗性基因序列设计引物Inverse-F-5’GCTGGTGCTGGAATGAGTTTG 3'，Inverse-R-5'TTGGTT GTGTCGTAAATTCG 3'，反向PCR确定四环素抗性基因上下游序列。

2 结果与讨论

2.1 生牛乳中芽孢杆菌的分离与鉴定

从34个生牛乳样品中分离并鉴定出66株产芽孢细菌，其中蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）38株（58%）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）3株（5%）、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）3株（5%）、沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis）2株（3%）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）3株（5%）、高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）1株（2%）、摩加夫芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）1株（2%）、越南芽孢杆菌（Bacillus wiedmannii）2株（3%）、魏登施泰芽孢杆菌（Bacillus weihenstephanensis）1株（2%）、漳州芽孢杆菌（Bacillus zhangzhouensis）2株（3%）、副黏菌芽孢杆菌（Bacillus paramycoides）4株（6%）、其他芽孢杆菌6株（9%）。

图1 生牛乳中芽孢杆菌分离情况

2.2 芽孢杆菌抗生素抗性筛查

对66个分离株进行药敏试验，共筛选出57株抗生素抗性菌株，分别为氨苄西林抗性（47株），青霉素抗性（50株），红霉素抗性（1株），克林霉素抗性（7株），四环素抗性（5株）。分离株均未表现出对美罗培南、环丙沙星、利福平、万古霉素、氯霉素、庆大霉素、复方新诺敏的抗性。菌种与抗生素抗性对应关系如表2。分离株中芽孢杆菌普遍对氨苄西林、青霉素具有抗性，表明氨苄西林、青霉素属于固有抗性。而四环素、红霉素和克林霉素抗性表型在分离株中并不具有普遍性，因此可能是菌株的获得性抗性。

表2 芽孢杆菌分离株耐药表型（n=66）

（续表2）

2.3 获得性耐药菌的质粒普查

为进一步定位获得性耐药菌株的耐药基因并探究其可移动性，使用质粒小提试剂盒，对13株具有获得性耐药表型的芽孢杆菌进行质粒提取。琼脂糖凝胶电泳检测结果表明仅有四环素抗性的蜡样芽孢杆菌S7和S11携带有质粒。如图2所示，通过同超螺旋DNA marker的比较，蜡样芽孢杆菌S7存在一个约5 kb的质粒，蜡样芽孢杆菌S11存在约2 kb的质粒。

图2 蜡样芽孢杆菌S7、S11质粒电泳图

2.4 四环素抗性基因的PCR扩增及定位

分别以S7、S11的质粒、基因组为DNA模板，扩增芽孢杆菌四环素耐药基因，扩增产物电泳图如图3。未见S7、S11质粒与基因组扩增出tetO清晰条带，tetA、tet B、tet W、tet K、tetM扩增产物均与参考文献中不符，测序分析表明均为非特异性扩增片段。使用tet L上下游引物，两株菌的质粒与基因组都扩增出略大于750 bp的条带，片段大小与文献相符。序列的比对分析发现扩增产物同tetL基因相似度达到100%，表明蜡样芽孢杆菌S7、S11中有tetL基因。以S7的质粒DNA为模板能够扩增获得tetL基因片段，说明tetL基因可能位于S7的质粒上。

图3 四环素抗性基因PCR扩增结果

为了定位tetL基因，以经纯化的S7质粒为模板，反向扩增tetL两侧基因，扩增产物电泳图谱如图4所示，CK为双蒸水代替模板的阴性对照。S7存在一条明显的约4 kb的条带。将S7扩增产物交由公司测序，产物序列与tetL序列拼接成环，获得质粒p BCs7的全序列，质粒大小为4 634 bp。对质粒全序列进行注释后，用Snap Gene绘制该质粒的物理图谱，如图5所示。该质粒包含四环素抗性基因tetL、两个移动蛋白基因mob_1和mob_2、质粒复制蛋白基因repU。质粒p BCs7能够编码的移动蛋白M ob，而M ob蛋白一般能够介导质粒的接合转移。对质粒p BCs7的核酸序列进行Blast比对分析，发现其同Heyndrickxia oleronia FW 1的质粒p AMalpha1（GenBank:CP079722.1）相似度为99.76%；同屎肠球菌E7654的质粒4（GenBank:LR 135327.1）相似度为99.75%；同金黄色葡萄球菌X 22的质粒（GenBank:CP042651.1）相似度为99.74%。因此，推测质粒p BCs7可能具有转移性，蜡样芽孢杆菌S7可能成为四环素耐药基因的供体菌。尽管我国乳制品生产标准中尚未要求对芽孢杆菌进行检测，携带有可移动的耐药基因的芽孢杆菌已经成为影响乳制品安全的潜在风险之一。研究表明，减少饲养环节的抗生素使用，改善养殖环境或挤奶过程的卫生条件，可以有效降低原料乳中耐药菌的数量[10]。在乳制品生产过程中，利用离心除芽孢机可以大幅降低原料乳中芽孢数量[11]，可以降低芽孢杆菌的耐药基因的传播。

图4 反向PCR电泳图

图5 pBCs7质粒物理图谱

3 结 论

本研究从34个生牛乳样品中分离鉴定出66株产芽孢细菌，包括蜡样芽孢杆菌38株、地衣芽孢杆菌3株、短小芽孢杆菌3株、沙福芽孢杆菌2株、枯草芽孢杆菌3株、高地芽孢杆菌1株、摩加夫芽孢杆菌1株、越南芽孢杆菌2株、魏登施泰芽孢杆菌1株、漳州芽孢杆菌2株、副黏菌芽孢杆菌4株、其他芽孢杆菌6株。药敏结果显示，在固有抗生素耐药性中氨苄西林耐药率高达71.21%，青霉素耐药率高达75.75%。在获得性耐药中7株芽孢杆菌具有克林霉素抗性，1株沙福芽孢杆菌具有红霉素抗性，5株蜡样芽孢杆菌具有四环素抗性。获得性耐药的菌株中，四环素抗性的蜡样芽孢杆菌S7和S11携带有质粒。进一步通过芽孢杆菌四环素耐药基因的PCR筛查及测序分析，确定S7和S11中四环素抗性基因为tetL。其中蜡样芽孢杆菌S7的tetL基因位于质粒上。通过反向PCR及DNA测序，获得该质粒p BCs7的全序列。该质粒大小为4634 bp，包含四环素抗性基因tetL、两个移动蛋白基因mob_1和mob_2、质粒复制蛋白基因repU。移动蛋白M ob能够介导质粒的水平转移，所以推测p BCs7上的四环素抗性基因tetL可能具有转移性。本研究结果说明，生牛乳中耐药芽孢杆菌具有四环素、克林霉素和红霉素等获得性抗生素抗性，其中四环素抗性基因tetL位于可移动元件上，可能通过接合转移方式在菌株之间传播，具有一定的食品安全风险。