基于免疫显色法分析137例儿童耐碳青霉烯革兰阴性菌的碳青霉烯酶表型

李 婵，陈 楠

天津市儿童医院检验科，天津 300134

革兰阴性菌是医院感染的关键病原菌，大部分具备多重耐药性，在全部β-内酰胺抗菌药物中，碳青霉烯类抗菌药物的抑菌活力最强。近年来，伴随着碳青霉烯类抗菌药物的广泛及不合理应用，革兰阴性菌对这种抗菌药物形成了越来越多的耐药性，不断有在儿童或新生儿群体中暴发感染的报道[1-2]。根据全国细菌耐药监测网(CRASS)数据显示，2019年儿童医院的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌检出率为14%，高于三级医院的11.6%和二级医院的5.5%，同时比2018年儿童医院的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌检出率(13.8%)增加0.2%。同时，耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌(CRAB)和耐碳青霉烯铜绿假单胞菌(CRPA)检出率随着碳青霉烯类抗菌药物的广泛和不合理使用也日益增多。产生碳青霉烯酶是肠杆菌科细菌对碳青霉烯类药物耐药最主要的机制[3]。本研究使用免疫显色法检测了本地区儿童临床分离的耐碳青霉烯革兰阴性菌产生的碳青霉烯酶表型，为临床合理使用抗菌药物提供依据，同时采用PCR检测对免疫显色法检测的结果进行验证，以明确此方法的准确性。

1 材料与方法

1.1材料 收集2019-2020年从本院住院患儿临床标本中分离得到的对亚胺培南或美罗培南耐药的肠杆菌科细菌(共75株,其中肺炎克雷伯菌53株、大肠埃希菌22株)和非发酵菌(共62株，其中鲍曼不动杆菌20株、铜绿假单胞菌42株)，去除同一患者的重复菌株。

1.2仪器与试剂 VITEK MS、VITEK 2 Compact、PCR扩增仪购自赛默飞世尔科技有限公司；KPC型与NDM型碳青霉烯酶免疫显色试剂盒、VIM型碳青霉烯酶免疫显色试剂盒、OXA-23型碳青霉烯酶免疫显色试剂盒、OXA-48型碳青霉烯酶免疫显色试剂盒购自北京金山川公司；亚胺培南和美罗培南药敏纸片购自赛默飞世尔科技有限公司。

1.3方法

1.3.1细菌的鉴定与药敏试验 采用VITEK MS和VITEK 2 Compact全自动微生物质谱检测系统和全自动微生物鉴定仪对肠杆菌科细菌及非发酵菌各自开展鉴定和药敏试验。选用纸片法(K-B法)核查全自动仪器对亚胺培南和/或美罗培南耐药性的检测结果，确定待测菌株对亚胺培南和/或美罗培南的耐药性与全自动仪器法检测结果一致，折点参照CLSI M100 S29中的规范。

1.3.2PCR检测耐药基因 (1)待测菌核酸提取：将挑选出的菌株接种于血平板，35 ℃恒温箱孵育18～24 h，挑单独菌落添加50 μL无菌dd H2O搅拌，100 ℃水浴10 min，裂解细菌释放出来DNA，以12 000 r/min离心5 min，取上清液检测吸光度(A)比值A260/A280，评估DNA提取质量。将得到的上清液分装，于-20 ℃保存。(2)引物设计及扩增5种碳青霉烯酶基因：耐药基因引物序列参考文献[4-5]，由金唯智生物科技(北京)有限公司合成。引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

续表1 PCR引物序列

1.3.3免疫显色法检测碳青霉烯酶表型 使用免疫显色试剂盒进行检测，严格按说明书进行操作。

1.4统计学处理 采用SPSS22.0软件进行数据处理。计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。采用WHONET5.6软件分析细菌耐药性。

2 结 果

2.1耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(CRE)的碳青霉烯酶表型分析

2.1.1PCR检测耐药基因 共检测出blaKPC型11株，全部为肺炎克雷伯菌；blaNDM型37株，包含23株肺炎克雷伯菌和14株大肠埃希菌；blaKPC+blaNDM混合型19株，均为肺炎克雷伯菌；blaNDM+blaOXA-23混合型3株，均为大肠埃希菌；另有5株大肠埃希菌的耐药机制不在检测的5种碳青霉烯酶表型范围内。

2.1.2免疫显色法检测碳青霉烯酶表型 共检测出blaKPC型12株，全部为肺炎克雷伯菌；blaNDM型40株，分别为23株肺炎克雷伯菌和17株大肠埃希菌；blaKPC+blaNDM混合型18株，均为肺炎克雷伯菌；blaOXA-23型1株，确认为大肠埃希菌；另有4株大肠埃希菌耐药机制不在检测的5种碳青霉烯酶表型范围内。

2.1.3免疫显色法检测碳青霉烯酶表型的效能评估 以PCR检测结果作为金标准，对免疫显色法检测碳青霉烯酶从符合率、灵敏度、特异度等方面进行评估，经χ2检验，两种方法检测碳青霉烯酶主要表型的结果比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。75株CRE用两种方法检测，blaVIM和blaOXA-48两种表型结果均为阴性。

表2 两种方法检测碳青霉烯酶主要表型的比较

2.262例儿童耐碳青霉烯非发酵菌的碳青霉烯酶表型分析

2.2.1PCR检测耐药基因 20株CRAB检测到3种碳青霉烯酶基因，分别为blaNDM型(12株)、blaNDM+blaKPC型(2株)、blaNDM+blaOXA-23型(1株),以blaNDM型为主；42株CRPA检测到blaKPC型23株。

2.2.2免疫显色法检测碳青霉烯酶表型 使用免疫显色法对碳青霉烯酶表达阳性的菌株进行检测，CRAB中检测到blaNDM型12株、blaNDM+blaKPC型1株、blaNDM+blaOXA-23型1株，CRPA中检测到21株blaKPC型。

2.2.3免疫显色法检测碳青霉烯酶表型的效能评估 以PCR结果为金标准，免疫显色法检测CRAB和CRPA碳青霉烯酶表型的灵敏度、特异度均较高。经χ2检验，两种方法检测的碳青霉烯酶表型结果比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 两种方法检测碳青霉烯酶主要表型的比较

2.3产碳青霉烯酶革兰阴性菌的耐药情况分析 CRE菌株对阿米卡星、庆大霉素和妥布霉素耐药率较低，而对头孢类抗菌药物的耐药率几乎都在90%以上；CRAB菌株对阿米卡星、四环素、妥布霉素等耐药率低；CRPA对阿米卡星耐药率低，对庆大霉素和妥布霉素耐药率在50%左右，见表4。

表4 耐碳青霉烯革兰阴性菌的耐药情况(%)

2.4产碳青霉烯酶革兰阴性菌的临床分布特征 <1岁的幼儿分离到CRE的比例明显高于≥1岁的儿童，而非发酵菌(CRAB和CRPA)则主要分离自1～10岁的儿童(64.5%)的临床标本。分离到CRE的患儿中，男性所占比例高于女性；分离到非发酵菌的患儿中，男性所占比例(58.1%)比女性(41.9%)略高；分离到CRE最多的临床标本类型是尿液(37.3%)，分离到非发酵菌最多的临床标本则是痰液(48.6%)。见表5。

表5 分离到产碳青霉烯酶革兰阴性菌的感染患儿临床特征及标本来源分析

3 讨 论

铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和肠杆菌科细菌多见于自然界、医疗环境中以及皮肤上。它们是目前临床中检出最多的革兰阴性菌，是医院门诊继发感染的关键致病菌，尤其是鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌，可引起全身多个部位的感染，是泛耐药菌中最常见的细菌。革兰阴性菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药性的报道越来越多，对于儿童该类报道的数量也在逐年增多,但大多数是小范围报道[6-7]。

本研究结果显示：CRE中，肺炎克雷伯菌产碳青霉烯酶表型分别为blaNDM(43.40%)、blaKPC+blaNDM(35.85%)、blaKPC(20.75%)，大肠埃希菌产碳青霉烯酶表型则分别为blaNDM(63.64%)、blaNDM+blaOXA-23(13.64%)、其他(22.73%)。肺炎克雷伯菌以blaNDM型(包含与blaKPC混合型)为主，与国内某大型儿童医院的77.3%blaNDM型肺炎克雷伯菌的报道基本一致[8]。大肠埃希菌也以blaNDM型为主，与blaNDM型大肠埃希菌的主要流行区域是亚洲大陆的中国和印度的报道一致[9-10]。但北京地区儿童患者分离的碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌是以blaKPC和blaIMP-4型金属酶为主。这种碳青霉烯酶类型不同的现象，可能与各地区使用抗菌药物种类不同有关[11]。而62株非发酵菌结果中，20株CRAB检测到3种碳青霉烯酶基因以blaNDM型为主，与王紫琦等[12]研究的以blaOXA-23型检出为主的结论不同，可能与地区和人群不同相关；42株CRPA以blaKPC为主。blaKPC型CRPA中带blaKPC-2基因质粒[13]，这种耐药特性将如同其在肠杆菌科细菌一样在铜绿假单胞菌中播散。

以PCR检测结果为金标准，免疫显色法检测CRE的3种主要表型blaKPC、blaNDM、blaOXA-43与PCR检测结果比较差异无统计学意义(P>0.05)。同时，免疫显色法对62株菌非发酵菌的结果也与PCR检测结果比较差异无统计学意义(P>0.05)。但有几株菌出现PCR阳性而免疫显色法阴性，可能是因为菌株中目标耐药基因的表达水平低于免疫显色法试剂的检测低限，而PCR通过扩增过程可以检测到。综上所述，PCR法与免疫显色法同样可以检测肠杆菌及非发酵菌的碳青霉烯酶耐药基因。

综上所述，肠杆菌和非发酵菌碳青霉烯酶耐药基因分型所使用的免疫显色法具有操作简便、报告快速、便于操作、不易污染等特点，而且可用于检测非发酵菌和肠杆菌科细菌，优于其他传统的检测方法，适合基层医疗机构实验室常规开展。但本研究的标本量偏少，需要日后积累更多的菌株后进行大样本量检测和分析，以期为临床个性化用药、及时准确地进行评估提供更多参考。