多指标成分测定筛选冰白含漱液提取工艺
2023-02-27李旭辰韩文静柳成林
高 颖，刘 乐，朱 明，李旭辰，韩文静，杨 涛，柳成林*
（1.联勤保障部队第964医院，长春 130021；2.长春中医药大学药学院，长春 130117；3.第93313部队，长春 130062）
随着人类生活水平不断提高，饮食结构发生改变的同时忽略了对口腔护理的关注，使得牙齿频繁出现问题，以及生活压力过大导致口腔溃疡等问题，都为人们的生活带来极大的不便。口腔异味、牙龈出血、牙齿敏感、口腔溃疡等问题，近些年来已经成为一个较为严重的公共卫生问题[1]。
冰白含漱液处方由黄柏、白及、冰片三味中药组成，主要用于抑制口腔内的细菌、抗过敏、预防口臭、清新口气等。现代药理学研究和临床研究证实黄柏的水煎液具有免疫调节作用[2]，其中小檗碱对真菌也有较强抑制作用；白及的有效成分具有促进伤口愈合、抗炎、抗菌等作用[3]。本研究对处方中的有效成分进行测定。
1 仪器与试药
1.1 仪器
高效液相色谱仪（型号：LC-20AT 日本岛津，SPD检测器）、超声波清洗器[型号：TP-300天鹏电子新技术（北京）有限公司]。
1.2 试药
标准品：黄柏碱、B12、DactylorhinA、B14购于成都普思生物科技有限公司（规格：每支20 mg，批号：ps000447、ps012009、ps011099、ps012643）；药根碱、巴马汀、盐酸小檗碱购于中国食品药品生物制品检定院（规格：每支20 mg，批号：0733-200005、0732-200005、110713-200911）。
2 方法与结果
2.1 黄柏多指标含量测定方法的建立
2.1.1 色谱条件 1）色谱柱：采用C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；2）流动相：乙腈：0.05 mol·L-1磷酸二氢钾（50:50）每100 mL加十二烷基硫酸钠0.4 g，pH = 4（A）和水（B），梯度洗脱（0～12 min，90% ～ 100%A；12～ 16 min，100%A；16～ 29 min，100% ～ 90%A；29～ 50 min，90%A；50 min，90%A），流动相B为100%-A；3）检测波长：283 nm、254 nm；4）柱温：室温；5）流速：1.0 mL·min-1；6）进样量：10 μL。
2.1.2 溶液的配制
2.1.2.1 对照品储备液 精密称取黄柏碱、药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱对照品分别为2.66 mg、1.08 mg、8.29 mg、8.25 mg，甲醇制备浓度分别为 0.532 mg·mL-1、0.216 mg·mL-1、1.658 mg·mL-1、1.650 mg·mL-1储备液。
2.1.2.2 混合对照品溶液 精密吸取黄柏碱、药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱对照品储备液，制成 浓 度 分 别 为 133.0 μg·mL-1、54.0 μg·mL-1、414.5 μg·mL-1、412.5 μg·mL-1的混合对照品溶液。
2.1.2.3 供试品溶液 按处方量，称取黄柏15 g，白及15 g，置于煎药锅中，煎煮3次，8倍量水，每次2 h，过滤得滤液，合并3次所得滤液，浓缩到适量体积，即得。
2.1.3 黄柏多指标含量测定的方法学考察
2.1.3.1 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL、10.0 mL、12.0 mL、14.0 mL、16.0 mL，液相色谱仪检测。绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表1。
表1 黄柏四个成分线性关系考察
2.1.3.2 仪器精密度试验 取同一对照品溶液，精密吸取10 μL，于不同时间、不同仪器、不同人员分别测定，连续进样6次，记录图谱。黄柏碱、药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱峰面积的RSD值分别为0.71%、0.69%、0.73%、0.77%。RSD平均值都小于1%。
2.1.3.3 稳定性考察 精密吸取供试品溶液 10 μL，按“2.1.1”条件在 0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h进样，记录色谱图，测得峰面积。结果黄柏碱、药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱峰面积的RSD值分别为2.50%，1.41%，0.65%，0.61%。
2.1.3.4 重复性考察 同一批次药材按 “2.1.2.3”制备供试品溶液，再按“2.1.1”色谱条件测定，记录色谱图，测定峰面积。结果黄柏碱、药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱峰面积的RSD值分别为1.25%，2.55%，1.50%，1.20%。
2.1.3.5 加样回收率考察 精密称取已知含量的样品 6 份，每份约2.5 g，置20 mL量瓶中，加甲醇和对照品适量按 “2.1.2.3”制备供试品溶液，再按“2.1.1”条件测定。结果黄柏碱、药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的平均回收率分别为97.79%，107.7%，102.88%，104.99%，RSD值分别为1.17%，0.96%，1.41%，1.23%。
2.2 白及多指标含量测定方法的建立
2.2.1 色谱条件 1）色谱柱：采用C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；2）流动相：乙腈：（A）和0.1%磷酸水（B），梯度洗脱（0～4 min，5%～8%A；4～5 min，8%A；5～6 min，8%～10%A；6～10 min，10%～12%A；10～24 min，12%～30%A；24～ 27 min，30% ～ 31%A；27～ 32 min，31%A；32～33 min，31%～37%A；33～40 min，37%～55%A ），流动相B为100%-A；3）检测波长：220 nm；4）柱温：室温；5）流速：1.0 mL·min-1；6）进样量：10 μL。
2.2.2 溶液的配制
2.2.2.1 对照品储备液 分别精密称取4-（葡糖糖氧基）-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯、dactylorhinA、1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品2.58 mg、7.17 mg、10.8 mg，甲醇溶液溶解并稀释浓度分别为0.516 mg·mL-1、1.434 mg·mL-1、2.160 mg·mL-1的4-（葡糖糖氧基）-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯、dactylorhinA、1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品储备液，备用。
2.2.2.2 混合对照品溶液 精密吸取4-（葡糖糖氧基）-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯、dactylorhinA、1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品储备液适量，混合均匀，配制成含4-（葡糖糖氧基）-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯、dactylorhinA、1，4-二［4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品浓度分别为 172 μg·mL-1、478 μg·mL-1、720 μg·mL-1的混合对照品溶液。
2.2.2.3 供试品溶液 同“2.1.2.3项下”供试品溶液制备方法。
2.2.3 白及多指标含量测定的方法学考察
2.2.3.1 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL、10.0 mL、12.0 mL、14.0 mL、16.0 mL，液相色谱仪检测。绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表2。
表2 白及三个成分线性关系考察
2.2.3.2 仪器精密度试验 取同一对照品溶液，精密吸取10 μL，于不同时间、不同仪器、不同人员分别测定，连续进样6次，记录图谱。4-（葡糖糖氧基）-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯、dactylorhinA、1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯峰面积的RSD值分别为0.34%、0.42%、0.40%。RSD平均值都＜1%。
2.2.3.3 稳定性考察 供试品溶液按“2.1.1”项下色谱条件分别在 0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h进样。结果4-（葡糖糖氧基）-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯、dactylorhinA、1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯峰面积的RSD值分别为0.70%，1.26%，0.68%。
2.2.3.4 重复性考察 同一批次药材按 “2.1.2.3”方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”条件测定。结果4-（葡糖糖氧基）-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯、dactylorhinA、1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯峰面积的RSD值分别为2.43%、1.60%、0.80%。表明该方法重复性良好。
2.2.3.5 加样回收率考察 精密称取已知含量的样品 6 份，每份约2.5 g，置20 mL量瓶中，加甲醇和对照品适量按“2.1.2.3”方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”条件测定。结果4-（葡糖糖氧基）-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯、dactylorhinA、1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯的平均回收率分别为105.03%、108.22%、107.05%，RSD值分别为1.24%、1.48%、1.45%。
2.3 冰白含漱液提取工艺优化的正交试验考察
2.3.1 综合评价冰白含漱液提取工艺
2.3.1.1 转移率的测定 以黄柏碱、药根碱、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、4-（葡糖糖氧基）-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯、dactylorhinA等7个有效成分的平均转移率考察冰白含漱液提取工艺。
2.3.1.2 出膏率的测定 精密吸取“2.1.2.3”项下供试品溶液，蒸发干燥至恒重。出膏率为浸膏质量与药材质量比值的百分数。
2.3.1.3 综合评价计算方法 均转移率权重系数70%，出膏率权重系数30%，综合评价冰白含漱液提取工艺。
2.3.2 基于综合评价的正交试验考察 提取次数（A）、溶剂用量（B）、提取时间（C）3种因素，每种因素 3 个水平，结果见表3、表4。
表3 提取的因素水平
表4 正交实验直观分析结果
根据方差结果可以判断，各因素对冰白含漱液中七种成分提取影响大小的顺序为A＞C＞B＞D，最佳提取工艺为A3B2C3D2。根据表5结果可以判断，A因素对各有效成分提取率呈显著性影响（P＜0.05），B、D因素在考察范围内影响较小，无显著性影响，C因素对各有效成分提取率有显著统计学差异（P＜0.01），考虑到大生产的成本问题，优选工艺为A3B1C3D1，即加6倍量提取3次，每次2 h，为冰白含漱液提取最佳工艺。
表5 方差分析结果
3 讨论
冰白含漱液由黄柏、白及、冰片三味中药组成。黄柏性苦寒，具有清热、消肿、止疼等功效[4]。黄柏有效成分具有抗炎杀菌等药理作用[5]，黄柏碱也具有抑制细胞免疫的作用[6]。白及作为传统中药，已经有2000多年的历史，其药理活性主要包括抗菌消炎、抗溃疡等方面[7]。近千年来，冰片在中药方剂中常作为佐使药使用。黄柏、白及、冰片三药配伍使得药物发挥更好的疗效[8]。
中药药方的功效是其所含成分综合作用得到的结果[9]。本研究选取冰白含漱液中的七种有效成分作为考察指标，建立了简单、高效、准确的含量测定方法[10]。提取工艺是制备过程中的重要环节，提取工艺决定着中药制剂的质量[11]。本研究以综合分数作为考察指标，通过正交实验设计考察提取次数、溶剂用量、提取时间对冰白含漱液中各指标提取工艺的影响，进一步确定了最佳的提取工艺为6倍量水，提取3次，每次2 h。研究结果为冰白含漱液的临床应用奠定了基础。
