“调理脾胃针刺法”对2型糖尿病肾病大鼠足细胞中PCX、CD2AP、nephrin、desmin表达的影响

刘 亮，董重阳，郝 华，胡锦华，沈少华，谭亚芹，刘白雪，王雄耀

（1.内蒙古医科大学中医学院针灸教研室，呼和浩特 010010；2.内蒙古医科大学中医学院中医基础理论教研室，呼和浩特 010010；3.天津市和平区新兴街社区卫生服务中心，天津 300070；4.内蒙古医科大学附属医院中医科，呼和浩特 010010）

经过三十余年的研究，课题组成员发现脾胃升降异常是2型糖尿病肾病的基本病机[1-2]，并创立“调理脾胃针刺法”，对患者的糖、脂代谢与免疫损伤都有良性调节作用[3]。尿蛋白是 糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）患者的典型症状之一，与肾小球基底膜改变有关。DN的主要病理变化是肾小球发生改变，足细胞的完整性是维持肾小球正常功能的基础，足细胞损伤是导致蛋白尿的最主要原因[4]。足细胞的结构蛋白发生改变，结构功能降低，而引起足细胞受损[5]。故本实验采用以高脂高糖饮食与低剂量腹腔注射链脲佐菌素（streptozocin，STZ） 联合诱导2型糖尿病肾病大鼠为实验对象，通过“调理脾胃针刺法”，即针刺干预双侧中脘、阴陵泉、合谷、三阴交、曲池、足三里、地机、百虫巢、丰隆、太冲，观察大鼠尿蛋白实验期的改变，检测肾组织系膜基质的含量，以及足细胞中的PCX、CD2AP、nephrin、desmin的 mRNA表达，进一步探寻“调理脾胃针刺法”改善2型糖尿病肾病的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 2型糖尿病肾病大鼠模型的制备方法

选取70只健康雄性SD大鼠（中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心供应），动物生产许可证号：SCXK-（军）2012-0004，体质量为150～180 g。动物房室温维持在（24±1）℃，相对湿度维持在60%左右。动物被安置在钢丝底笼内，每笼5只，实验动物在实验期间自由摄取食物和饮水，动物房内设置12 h昼夜循环标准。天津医科大学实验动物中心动物伦理委员会批准了本实验的研究议定书（伦理批件编号：TMUaMEC2016008）。

采用空腹腹腔注射STZ的方法制备模型[6]。造模前将造模组先禁食12 h，不限制饮水，并根据体质量一次性快速在腹部注射STZ溶液，STZ以0.1 mol柠檬酸盐缓冲液配制，pH 4.3。配置后需在避光低温下静置，30 min内使用完，按注射体积10 mL·kg-1、注射剂量30 mg·kg-1、STZ浓度3 g·L-1注射。注射完成72 h后，在尾静脉取血，使用血糖仪测量血糖，以5 d连续随机测血糖＞16.7 mmo·L-1者，为2型糖尿病造模成功，经尿蛋白定性检测结果非阴性为2型糖尿病肾病大鼠造模成功[7]。

1.2 实验试剂和仪器

一次性无菌的针灸针（0.30 mm×15 mm，苏州医疗用品厂有限公司）；All-in-OneTM qPCR Mix（ 美 国 GeneCopoeia公 司，批 号：AOPR-0200）；CD2AP、PCX、nephrin、desmin上、游下游的合成引物[生工生物工程（上海）公司，批 号：8401615170/8401615171；8401615166/8401615167；BN61204-0001/BN61204-0002；8401615168/8401615169]。GAPDH 上、下 游 的合成引物 [生工生物工程（上海）公司，批号：BN61204-0001/BN61204-0004]；尿蛋白定量测试盒（南京建成，批号：C035-2）；ABI 2720型PCR基因扩增仪（美国Applied Biosystems公司）；石蜡切片机（德国SLEE公司）；显微镜（日本奥林巴斯公司，型号：CX31-72C02）。

1.3 分组与干预方法

将造模成功的36只大鼠按照血糖值，以及尿蛋白定性结果构成比，采用分层随机的方法分为针刺组4周（n= 6），模型组4周（n= 6）；针刺组8周（n= 6），模型组8周（n= 6）；针刺组12周（n= 6），模型组12周（n= 6）。空白组大鼠随机分为空白组4周（n= 6）、空白组8周（n= 6）、空白组12周（n= 6）。将针刺组穿着针刺罩衣后固定，采用“调理脾胃针刺法”干预，取双侧曲池、足三里、地机、中脘、阴陵泉、合谷、三阴交、百虫巢、丰隆、太冲，将T2DN大鼠置于自制大鼠针刺罩衣中处于仰卧位，固定于操作台，大鼠躁动基本可控，使多只同时行针刺操作具有可行性。而后针具与穴位常规消毒，选用一次性无菌针灸针（材质：不锈钢，直径0.3 mm，长度13 mm）进行针刺，留针1～2 mm，每次留针30 min，不做手法，每日1次，每周6次，分别针刺4周、8周、12周。模型组和空白组与针刺组同时抓取，抓取程度相同。

1.4 尿蛋白含量检测

T2DN大鼠肾功能下降的主要表现是出现蛋白尿。于第4周末、第8周末、第12周末使用代谢笼收集大鼠24 h尿，于每天上午同一时间搜集尿液，并于量筒中计算每日尿量。收集 24 h尿液用以测定尿蛋白含量并测量体积。经离心后检测。

1.5 qPCR法检测PCX、CD2AP、nephrin和desmin的mRNA表达水平

针刺4、8及12周后，分批处死大鼠。具体方法：用10%水合氯酸溶液腹腔注射将大鼠麻醉，打开腹腔，推离肠管，分离脊柱前脂肪，暴露出腹主动脉，在其远心端结扎，头皮针穿刺后采血，分离血清，立即送检。取双肾后去除包膜，之后在4%多聚甲醛固定液中将肾脏浸泡。其余的部分分不同固定液固定，用于免疫组化检测，部分用液氮快速冷冻后，放置于-80℃ 的冰箱备用。利用荧光定量PCR法检测糖尿病肾病SD大鼠泡肾脏组织PCX、CD2AP、nephrin和desmin的 mRNA表达水平。

1.6 统计学方法

使用SPSS 24.0统计软件进行统计学分析。PCX、CD2AP、nephrin和 desmin的 mRNA表 达水平以均数±标准差（±s）表示。多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4周、8周及12周后各组24 h UPro水平比较

见表1。

表1 4周、8周及12周后各组24 h UPro水平比较（±s，n = 6） mg·24 h-1

表1 4周、8周及12周后各组24 h UPro水平比较（±s，n = 6） mg·24 h-1

注：与空白组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；△△P＜0.01

组别 24 h UPro 4 周 8 周 12 周空白组 0.36±0.10 0.64±0.17 0.67±0.12模型组 3.65±1.89# 4.65±1.44# 5.23±1.64#针刺组 1.17±1.08△ 1.23±0.27△△ 1.52±0.40△△

2.2 qPCR法检测PCX、CD2AP、nephrin和desmin的mRNA表达水平

见表2。

表2 各组CD2AP、PCX、nephrin、desmin的mRNA水平比较（±s，n= 6）

表2 各组CD2AP、PCX、nephrin、desmin的mRNA水平比较（±s，n= 6）

注：与空白组比较，## P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01

mRNA 时间/周 空白组 模型组 针刺组CD2AP 4 1.03±0.06 0.27±0.04## 0.60±0.13△△8 1.00±0.06 0.30±0.05## 0.74±0.06△△12 1.03±0.08 0.30±0.05## 0.63±0.06△△PCX 4 1.00±0.08 0.35±0.09## 0.61±0.08△△8 1.00±0.05 0.32±0.03## 0.62±0.06△△12 1.07±0.07 0.33±0.06## 0.69±0.03△△nephrin 4 1.03±0.10 0.45±0.08## 0.65±0.07△△8 1.04±0.07 0.47±0.06## 0.73±0.06△△12 1.06±0.08 0.38±0.03## 0.69±0.08△△desmin 4 1.04±0.08 2.65±0.50## 1.45±0.17△△8 1.00±0.03 2.85±0.17## 1.45±0.06△△12 1.08±0.05 2.83±0.33## 1.44±0.07△△

2.3 HE法检测各组肾脏形态学变化

4周、8周及12周后3组肾脏HE染色显示，在整个实验过程中，空白组的肾组织未见明显的病理变化。模型组肾小球增生，部分肾小管管腔变窄，散在炎性细胞浸润，基底膜轻度增厚，系膜基质增生。针刺组上述病理变化均小于模型组。“调理脾胃针刺法”可通过减轻肾小球基底膜增厚等病理变化，减轻肾损伤。见图2。

图2 4周、8周及12周各组肾脏形态学表现（HE，×400）

3 讨论

DN作为一种足细胞病[8]，其发生的始动环节是足细胞损伤，在细胞层面上表现多为与足突相关蛋白的异常表达。其中，Nephrin是裂孔膜蛋白，支撑足细胞结构和功能[9]。顶膜区足盂（Podocalyxin，PCX）维持足突结构的稳定性和保障电荷屏障的完整性[10]，CD2AP 蛋白具有抗凋亡的功效[11]。“调理脾胃针刺法”可通过提高T2DN大鼠肾脏足细胞PCX、CD2AP、nephrin基因表达的水平进而改善足细胞损伤，而结蛋白desmin作为一种足细胞的损伤标记物，足细胞损伤通过针刺作用降低desmin基因表达的水平得以修复。本研究发现“调理脾胃针刺法”可改善2型糖尿病肾病大鼠血脂及肾功能，降低24 h尿蛋白含量。通过提高T2DN大鼠肾脏足细胞PCX、CD2AP、nephrin基因表达的水平，降低desmin基因表达的水平，以改善T2DN大鼠足细胞损伤，肾小球基底膜增厚等病理改变减轻，从而延缓T2DN的进展，其降低尿蛋白含量的作用机制与此相关，持续的针刺治疗，可对该病起到良性维持作用，对T2DN早期临床防治具有重要意义。