不同植物免疫诱抗剂对枸杞鲜果产量、抗病性和贮藏能力的差异比较

李永晖，李 捷，2，*，冯丽丹，何 静，2，张 煦，刘祥林

(1.甘肃农业大学 林学院，甘肃 兰州 730070； 2.甘肃省枸杞无害化栽培工程研究中心，甘肃 兰州 730070； 3.甘肃农业大学 食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070)

1972年，Keen等[1]首次提出植物免疫诱抗剂(elicitor)的概念，具体来说，就是一类能够激活植物产生防卫反应因子的化合物。当前，植物免疫诱抗剂已成为国际上生物农药创制中较为热门的研究领域[2]。植物免疫诱抗剂可以有效提高作物的抗病性和防御能力，可用于防控作物病害[3]。大量研究结果已经证实了植物免疫诱抗剂的有效性，例如：β-氨基丁酸可诱导番茄(Lycopersiconesculentum)植株产生对灰霉病的抗性[4]，可诱导碧桃(Amygdaluspersica)产生采后抗逆性[5]；乙酰水杨酸可诱导改善石榴(Punicagranatum)果实的锈斑症状[6]；外源茉莉酸可以诱导提高玉米(Zeamays)全株的防御能力[7]。

枸杞(LyciumbararumL.)是茄科枸杞属植物，果实具有极高的营养、保健和经济价值。在枸杞生产中，病虫害发生种类较多，易导致大面积的减产和品质下降，生产上主要依靠农药控制病虫害，但这会给枸杞果实产品的安全性带来隐患。目前，农药残留超标已成为我国枸杞出口所遭遇的主要技术性贸易壁垒[8]。枸杞鲜果采收后极易腐烂[9]，若不及时加工，会极大地影响干果品质。为了充分发挥枸杞的价值，保障种植户的经济效益，促进枸杞产业健康持续发展，有必要增强枸杞果实的抗病能力，延长枸杞保鲜期，减少枸杞栽培和制干过程中杀菌剂的使用。

叶面喷施植物免疫诱抗剂有望提高枸杞的抗病能力，降低杀菌剂使用量与枸杞果实上的农药残留，延长果实保鲜时长。为此，本研究以正常管理地块6年生的宁杞7号枸杞植株为试材，通过完全随机区组设计，以正常喷施杀菌剂和清水为对照，从枸杞幼果期开始，检测分析不同植物免疫诱抗剂和诱导时长对宁杞7号产量、采后保鲜贮藏性和诱导抗病性的影响，旨在探明适用于宁杞7号叶面喷施的免疫诱抗剂种类与施用方法，为提高枸杞果实抗病能力，降低生产中杀菌剂的使用，降低枸杞加工前的产量损失提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地点位于甘肃省武威市古浪县大靖镇大墩村(37.542°N，103.501°E)，海拔1 930 m。供试土壤的基本理化性状：pH值8.46，有机质含量10.30 g·kg-1，全氮含量0.79 g·kg-1，全磷含量0.85 g·kg-1，全钾含量20.0 g·kg-1。

1.2 试验材料

枸杞供试品种为宁杞7号，正常水肥土壤管理，6年生，生长良好。

植物免疫诱抗剂：乙酰水杨酸(ASA，CAS No.：50-78-2，分析纯)、茉莉酸甲酯(MeJA，CAS No.： 33924-52-2，分析纯)，天津市光复精细化工研究所；β-氨基丁酸(BABA，CAS No.：541-48-0，分析纯)，上海源叶生物科技有限公司；氨基寡糖素5%的水剂(AOS)，海南正业中农高科股份有限公司。

1.3 试验设计

以10株宁杞7号为一个重复，每处理3次重复，每重复随机分布于试验小区内。

植物免疫诱抗剂的用法如下：ASA参照胡彦江[10]的研究设置为3 mmol·L-1，MeJA参照向妙莲[11]的研究设置为0.3 mmol·L-1，BABA参照王静[12]的研究设置为1 mg·mL-1，AOS按照厂家推荐浓度设置为1 000倍液。试验另设置杀菌剂对照(FC)和清水对照(BC)。其中，FC处理于6月5日喷施750 mL·hm-2的25%苯醚甲环唑和1.5 kg·hm-2的50%多菌灵，6月28日喷施750 mL·hm-2的20%吡唑醚菌酯和1.125 kg·hm-2的70%甲基硫菌灵(各药剂的浓度按使用说明配制，使用时间和使用次数与农户一致)。在配制ASA、MeJA、BABA溶液时，均加入0.5 mL·L-1的吐温-80，在BC对照中同样加入0.5 mL·L-1的吐温-80。从5月下旬第1茬果坐果后开始喷施，每周喷施1次，选择在无风的阴天或晴天的17：00喷施，具体地，分别在5月23日、5月30日、6月6日、6月14日、6月21日各喷施1次，共喷施5次。

分别在最后一次施药后14 d(7月5日)、21 d(7月12日)和28 d(7月19日)时采摘成熟果实，即为当年的第1茬、第2茬和第3茬果。采摘鲜果，测定单果重、单株产量、自然发病率、失重率等指标。挑选大小、色泽基本一致，无机械损伤的果实，用锡箔纸按照每份3 g的规格分包，每个样品30份，液氮速冻后转移至-80 ℃超低温冰箱中保存，用于测定其他指标。

1.4 指标测定

每茬果实成熟时，按处理单株采摘，称取每株枸杞的本茬果实质量。每个处理取3株的均值作为平均单株产量。测定时除去果梗，精确到0.01 g。

每茬果实按处理混合，随机选取20粒，称取总质量，计算单果重。重复3次，取平均值。测定时同样除去果梗，精确到0.01 g。

自然发病率测定：参照范存斐等[13]的方法。选取每茬成熟，无病虫害、无瑕疵，大小均匀的枸杞果实100粒，按处理放置于(25±2)℃、相对湿度(RH)65%～75%的条件下，定期进行观察，统计果实的自然发病情况，以果实表皮出现肉眼可见病斑为发病，计算自然发病率。每个处理重复3次。

选取每茬成熟果实，按处理混合随机选取100粒，测定储存前的质量。之后，放置于(25±2)℃、RH 55%～65%的条件下在培养皿中贮藏7 d，测定储存后的质量，计算果实保鲜失重率。每个处理重复3次。

1.5 数据分析

采用GraphPad Prism 8.0.2软件对试验数据进行统计并作图。对试验数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，对有显著(P<0.05)差异的，采用Duncan检验进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 对枸杞果实产量的影响

叶面喷施4种植物免疫诱抗剂后，宁杞7号1～3茬的单株产量均以BABA处理最高(图1)，显著高于其他处理。BABA处理第1茬枸杞的产量比FC和BC分别提高了65.07%、237.32%；第2茬的产量比FC和BC分别提高了82.36%和203.87%；第3茬的产量比FC和BC分别提高了24.66%和88.51%。

柱上无相同字母的表示差异显著(P<0.05)。下同。

叶面喷施4种植物免疫诱抗剂后，宁杞7号第1、3茬的单果重无显著差异；但在第2茬，ASA和BABA处理的单果重显著高于其他处理和2个对照，ASA的单果重较FC和BC分别高出17.66%、12.50%，BABA的单果重较FC和BC分别高出18.73%、13.51%。

2.2 对枸杞自然发病率和失重率的影响

叶面喷施4种植物免疫诱抗剂后，宁杞7号果实采后的自然发病率在第1茬较两个对照显著降低(图2)，喷施ASA较FC和BC分别显著下降54.55%、61.83%，喷施BABA较FC和BC分别显著下降44.27%、55.73%。在第2茬，宁杞7号果实的自然发病率以BABA处理最低，比FC和BC分别显著降低了73.45%和73.91%，其次为ASA处理，比FC和BC处理分别显著降低了46.90%和47.82%。在第3茬，除BC处理下果实的自然发病率显著最高外，其他处理间并无显著差异。

图2 不同处理对宁杞7号果实自然发病率和失重率的影响

叶面喷施4种植物免疫诱抗剂后，宁杞7号果实采后的失重率在1～3茬均显著低于BC对照。在第1茬，AOS处理的失重率显著高于FC和喷施其他植物免疫诱抗剂的处理；在第2茬，除BC外，各处理的失重率均无显著差异；在第3茬，BABA和AOS处理的失重率显著低于FC，喷施另外2种植物免疫诱抗剂的失重率则与FC无显著差异。总的来看，相较于喷施杀菌剂，喷施4种植物免疫诱抗剂并不会对宁杞7号果实采后的贮藏性能产生明显不利影响，选用合适的植物免疫诱抗剂甚至更有利于果实的贮藏。对比BABA与BC处理下宁杞7号贮藏7 d后的果实(图3)，亦可得出相似结果。

图3 BABA与BC处理下宁杞7号果实贮藏7 d时的失水与腐烂情况对比

2.3 对枸杞果实活性氧代谢途径的影响

活性氧代谢途径的稳定决定着植物生理活动的稳定性，较低的活性氧含量和较高的抗氧化酶活性，可以有效降低脂质过氧化程度，减少脂质过氧化产物的积累，从而减少机体损伤[18-20]。

图4 不同处理对宁杞7号果实活性氧(ROS)代谢的影响

叶面喷施ASA、MeJA和BABA后，宁杞7号第1、2茬果实中的SOD活性显著高于FC和BC，但在第3茬，其活性已不再显著高于FC和BC，叶面喷施MeJA的果实SOD活性甚至已显著低于FC和BC处理。叶面喷施AOS后，宁杞7号第1、3茬果实中的SOD活性显著高于FC和BC，但在第2茬果实中，三者并无显著差异。

喷施4种植物免疫诱抗剂后，宁杞7号第1～3茬果实H2O2含量与BC的差异无明显规律性。在第1茬果实中，喷施AOS的H2O2含量最高(55.39 μg·g-1)，与BC无显著差异，但显著高于FC，而喷施ASA、MeJA和BABA的H2O2含量均显著低于FC和BC；在第2茬果实中，喷施MeJA和BABA处理的H2O2含量显著高于FC和BC，而喷施AOS和ASA处理的H2O2含量显著低于FC；在第3茬果实中，喷施4种植物免疫诱抗剂的H2O2含量均显著低于FC和BC。

叶面喷施BABA和AOS后，宁杞7号第1～3茬果实中的POD活性均显著高于两个对照；叶面喷施ASA后，宁杞7号第1～3茬果实中的POD活性均显著高于BC，且第1、2茬果实中的POD活性还显著高于FC；叶面喷施MeJA后，宁杞7号第1～3茬果实中的POD活性均显著高于BC，第2茬果实中的POD活性显著低于FC。

2.4 对枸杞果实苯丙烷代谢途径的影响

苯丙烷代谢途径是植物抗病过程中的重要途径，其代谢产物具有很强的抗氧化活性，可以调节植物体内的氧化还原平衡[21]。

叶面喷施ASA、BABA、AOS可诱导宁杞7号果实产生较高的PAL活性(图5)，尤其是喷施BABA的，其前3茬果实中的PAL活性均最高，3茬平均值达到214.50 μg·g-1·h-1，显著高于FC和BC，分别提高了139.28%和381.54%。喷施AOS和ASA的，虽然第1茬果实中的PAL活性与FC无差异，但均显著高于BC，且其第2、3茬果实的PAL活性均显著高于FC和BC。喷施MeJA的PAL活性在第2、3茬果实中与FC无显著差异，但在第1茬果实中显著更低。

图5 不同处理对宁杞7号果实苯丙烷代谢的影响

总酚和类黄酮是苯丙烷代谢的重要产物，有很强的抗氧化能力。与BC相比，叶面喷施4种植物免疫诱抗剂，均有助于宁杞7号果实中总酚和黄酮含量的增加，但部分处理下差异不显著。喷施ASA后，第1茬果实中的总酚和类黄酮含量显著高于FC和BC，第2茬三者无显著差异，第3茬果实中的总酚和类黄酮含量显著高于BC，但与FC差异不显著。喷施MeJA后，第1～3茬果实中的总酚、类黄酮含量始终显著高于BC，但与FC的总酚含量无显著差异，第1茬果实中的类黄酮含量显著高于FC，但在第2、3茬果实中二者差异不显著。喷施BABA后，第1、3茬果实的总酚和类黄酮含量显著高于FC和BC，第2茬果实的总酚和类黄酮含量与两个对照均无显著差异。喷施AOS后，第1茬果实中的总酚含量显著高于FC和BC，但类黄酮含量显著低于FC，显著高于BC；第2茬果实中的总酚含量显著高于BC，但与FC无显著差异，类黄酮含量与两个对照均无显著差异；第3茬果实中的总酚和类黄酮含量显著低于FC，但与BC无显著差异。

3 讨论

植物免疫诱抗剂能诱导植物获得或提高对病原菌的抗性，也可以激发植物体内的代谢调控过程，促进植物生长，增加作物产量[22-23]。研究显示，外源水杨酸(SA)能有效促进Moneymaker番茄SA突变体的生长发育，显著提高其对灰葡萄孢(Botrytiscinerea)的抗性[24]。采前叶面喷施BABA可延长蓝丰蓝莓(Vacciniumuliginosumcv. Lanfeng)在2 ℃条件下的贮藏时间，有效缓解采后果实腐烂[25]。采后BABA浸泡葡萄(Vitisvinifera)果实可诱导产生敏化反应，可长时间维持果实储藏品质[26]。本研究表明，叶面喷施适宜的植物免疫诱抗剂能提高宁杞7号枸杞的单株产量和单果重，降低失重率和自然发病率；其中，喷施1 mg·mL-1BABA诱导21 d，可显著提高单株产量和单果重，降低果实自然发病率。由此可见，叶面喷施1 mg·mL-1BABA诱导可在提升宁杞7号果实产量的同时延长保鲜时间。

苯丙烷类代谢途径是绿原酸、木质素、黄酮和花青素等植物次生代谢产物合成的重要途径[37-38]。植物中许多主要的抗菌物质均由苯丙烷代谢直接或间接生成。酚类是苯丙烷代谢的末端产物，具有一定的抗菌作用。大量研究显示，PAL活性、黄酮和总酚含量受诱导升高时，植株的抗病能力增强。3.2 mg·mL-1ASA处理甜瓜(Cucumismelo)，可诱导PAL活性上升，总酚、黄酮和几丁质积累，诱发甜瓜对白腐病(Fusariumsulphureum)的抗病反应[39]。MeJA处理可提高受损伤胡萝卜(Daucuscarota)的PAL活性，促进总酚、黄酮等物质的积累[40]。BABA处理草莓(Fragaria×ananassa)可以提高植株的PAL活性，促进酚类和花青素积累，有效延长储存时长[41]；同时，可诱导草莓几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶和PAL活性上升，抑制菌丝扩张，有效提高对灰霉病的抗性[42]。BABA还可以通过H2O2介导的信号通路激发冬枣(Zizyphusjujubacv. Dongzao)的苯丙烷代谢，使几丁质积累，有效减少采后由链格孢菌(Alternariaalternata)引起的腐烂[43]。BABA在火龙果(Hylocereusundatus)[44]上也可诱导类似的抗病反应。壳聚糖复合物可诱导冬枣果实苯丙烷代谢途径，增强果实抗病性[45]。本研究表明，叶面喷施适宜的植物免疫诱抗剂，可以提高宁杞7号果实的PAL活性，其中，以BABA对PAL的诱导效果最为突出。叶面喷施ASA、MeJA和BABA能有效提高果实总酚和类黄酮的含量，其中，同样以BABA的诱导效果最佳。这说明，叶面喷施1 mg·mL-1BABA，可激活宁杞7号果实中苯丙烷代谢中的PAL活性，促进总酚和类黄酮的积累，进而增强宁杞7号果实采后的抗病性。

综上，叶面喷施ASA、MeJA、BABA和AOS等4种植物免疫诱抗剂对宁杞7号的果实产量、抗病性和贮藏能力有不同的诱导效果，其中，以BABA的诱导效果较为理想。从枸杞幼果期开始，每7 d叶面喷施1次1 mg·mL-1的BABA，连续喷施5次，诱导21 d后可降低果实中的活性氧含量，提高ROS代谢酶活性、苯丙烷代谢防御酶活性和抗菌物质含量，进而提高果实的抗病性和果实产量，提升果实采后贮藏品质。因此，可考虑在生产中利用叶面喷施1 mg·mL-1BABA的方法减少枸杞生产中杀菌剂的使用，并有效延长果实保鲜期。

但要说明的是，本研究在大田条件下通过叶面喷施4种植物免疫诱抗剂对宁杞7号植株进行处理，仅对果实活性氧和苯丙烷代谢中部分酶的变化进行了研究，未对活性氧代谢、苯丙烷代谢进行深入分析，也未从呼吸代谢、能量代谢方面进行深入研究。今后可考虑通过深入上述内容，为进一步揭示植物免疫诱抗剂对枸杞果实产量和贮藏性能的影响机制提供科学依据。