贵州省烟草青枯病害区根际土壤养分及酶活性特征分析

杨胜竹，李 响，李朝文，2，陈海念，刘 丽，2，*，陆引罡，2，3，曹卓洋

(1.贵州大学 农学院，贵州 贵阳 550025； 2.贵州大学 新型肥料资源与技术研究所，贵州 贵阳 550025； 3.贵州省烟草品质研究重点实验室，贵州 贵阳 550025； 4.上海市环境保护信息中心，上海 200235)

根际是植物根系与土壤的纽带，是土壤最活跃的微区域[1-2]，根际环境会影响作物生产力、养分效率，以及病害的发病率与病情指数，对植物的生长和健康至关重要[3-4]。青枯病是由茄科劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的最严重的烟草土传病害之一，危害着中国多个植烟区[5]。烟草发生青枯病害，其根际环境必然适宜于病原菌存活，并展现出异于健康烟草根际环境的特征。如与健康烟草根际环境相比，罹病烟株土壤pH值、有机质及速效养分含量(碱解氮、速效磷、速效钾等)[6]、过氧化氢酶活性、转化酶活性[7]等通常较低。但植烟区域所处地区不一致，其光温水条件等存在一定差异，不同地区二者之间根际环境特征的差异可能并不相同。如清江流域烟区研究结果表明，土壤有机质、有机氮含量偏高导致烟草青枯病发生严重[8]，而重庆烟区的土壤有机质含量偏低导致青枯病严重发生[9]；重庆市彭水县[10]和重庆市黔江植[9]烟区关于碱解氮与烟草发病率的关系也不尽一致。

近三年贵州烟草种植总面积占全国总种植面积的12.2%，常年来稳居全国第二，在国内甚至全球的烟草市场上都有着巨大的竞争力[11]。然而，该省气候复杂，属典型立体气候，致使黔东南低山丘陵区、黔中丘陵盆地区和黔西北川南高原山地区3个植烟区域的烟草青枯病发生流行轻重程度各不相同[12]。此外，受喀斯特地形地貌限制，贵州省耕地资源极其贫乏，即使烟草是忌连作的植物[13]，连作现象仍普遍发生[14]。由于劳尔氏菌在无寄主的情况下仍能在土壤中长期存活并具有高度可变性[15]，贵州省青枯病害频频爆发，连作更是加剧了此病害。改善土壤理化条件、保证土壤营养平衡是控制土传病害发生流行的关键[8-9]，但是目前关于贵州省不同气候区土壤营养状况与烟草青枯病发生的关系尚缺乏系统研究和分析。因此，本研究以上述3个气候区为研究区域，分析贵州省患青枯病烟区健康和患病烟株根际土壤理化性质及酶活性特征，摸清气候对青枯病发生与否的烟草根际土壤养分及酶活性特征差异的影响，为从土壤营养方向研究烟草青枯病的防控提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 研究区域概况

本研究以贵州省中亚热带季风性暖湿气候黔东南低山丘陵区、北亚热带季风湿润气候黔中丘陵盆地区和亚热带季风性湿润气候黔西北川南高原山地区三大气候区为研究区域，选取天柱县(TZ，温热湿润、降水丰沛)、开阳县(KY，温和湿润、水热同季)和威宁县(WN，温凉春旱、多日照雨量充沛、雨热同季、湿度较大)分别作为各区域的代表性试验点，各试验点烟草种植季节气温变化如图1所示。各试验点以云烟87种植区域为随机采样点，采样点基本情况如图2所示。

图1 2018年烟草种植期试验点气温变化动态

该图基于国家测绘局标准地图服务网站下载的审图号为GS(2019)1822号的标准地图制作，底图无修改。

1.2 试验设计与样品采集

试验设健康(H，烟株无患青枯病迹象)和发病(D，烟株青枯病发病等级高于5级)两个处理，多点随机区组设计，5次重复。即在3个气候区的代表性试验点KY、TZ和WN随机选取5个乡镇的长期种植烟草的区域作为试验小区，在烟草青枯病害普遍发生时(2018年7月底)于各试验小区随机采集5株发病烟株和5株健康烟株根际土壤，并各自混匀作为各试验小区根际土壤样品。

根际土取样方法：铲去烟株周围表层3 cm深的土壤，用铁铲在距烟株茎秆为中心半径约25 cm的圆外深挖，将烟株根系完整取出，去除大块土壤，轻轻抖烟株去除小颗粒土壤，最后将围绕根面1～4 mm的薄层土壤装入自封袋内。

1.3 测定指标

土壤养分：pH值采用电位法测定；有机质(OM)采用重铬酸钾容量法-外加热法测定；全氮(TN)采用半微量开氏法测定；碱解氮(AN)采用碱解扩散法测定；全磷(TP)采用HClO4-H2SO4法测定；中性和石灰性土壤的有效磷(AP)采用NaHCO3法测定，酸性土壤采用NH4F-HCl法测定；全钾(TK)采用碱熔融-火焰光度法测定；速效钾(AK)采用NH4OAc浸提-火焰光度法测定；阳离子交换量(CEC)采用EDTA-乙酸铵交换法[16]测定。

土壤酶活性：过氧化氢酶(CAT)活性采用容量法测定；脲酶(Ure)活性采用苯酚钠-次氯酸钠比色法测定；磷酸酶(Pho)活性采用磷酸苯二钠比色法[17]测定。

1.4 数据分析

采用Microsoft Excel 2016对数据进行整理，利用DPS 18.01数据处理系统进行多点随机区组试验统计分析(Duncan法，P<0.05)、因子分析和逐步判别分析，用ArcMap 10.2绘制采样点基本情况，利用R4.0.2的Hmisc包对数据进行Pearson相关性分析，并用Corrplot包绘图。

2 结果与分析

2.1 烟草根际土壤养分特征

如表1所示，整体而言，除AK和患病土壤的AN外，其余养分指标含量均在植烟土壤适宜养分含量范围内，且健康烟株和患病烟株根际土壤养分含量有显著性差异。患青枯病烟株(D)根际土壤OM、CEC、TN、AN、TP、TK及AK的含量显著高于健康烟株(H)，分别提高26.62%、12.68%、34.71%、34.54%、18.89%、8.01%和45.20%，pH值和AP含量则显著低于H，分别降低了4.66%和25.98%。

表1 健康(H)与患病(D)烟草根际土壤养分差异

如图3所示，天柱(TZ)气候下的TN和AK含量比H显著高32.75%和61.06%，AP含量比H显著低32.75%；开阳(KY)气候下的CEC和TK比H显著高15.66%和11.25%，pH值比H显著低8.01%；威宁(WN)气候下的OM、CEC、TN、AN、TP及TK含量比H分别显著高38.86%、10.57%、71.41%、51.30%、26.99%和60.34%。由此可见，随着海拔的升高，尤其是在威宁黔西北高海拔的亚热带季风性湿润气候下，呈升高趋势的患病烟株根际土壤养分与健康之间的差异愈发明显，但呈降低趋势的指标在高海拔下的二者之间并无差异。

柱上小写字母表示处理间差异达0.05显著水平。TZ，天柱；KY，开阳；WN，威宁。下同。

2.2 烟草根际土壤酶活性特征

根际土壤过氧化氢酶(CAT)、脲酶(Ure)和磷酸酶(Pho)3种酶活性受气候变化影响显著(表2)。多重比较结果表明，患青枯病烟株根际土壤相比于H，CAT显著提高，Ure显著降低，但Pho在H和D间无差异；受气候环境的影响，CAT和Pho活性仅在WN下表现出显著差异，与H相比，前者增加了34.47%，后者降低了28.41%，Ure仅在KY地区的H和D间差异达到显著性，D相比于H降低了42.37%。可见，烟草根际CAT和Ure的活性在健康与患病烟株根际土壤之间存在显著差异，Pho无差异，但在WN黔西北亚热带季风性湿润气候环境影响下酶活性变化更为显著。

表2 健康(H)与患病(D)烟株根际土壤酶活性差异

2.3 土壤养分及酶活性的相关性分析

健康烟株根际土壤(H)和患病烟株根际土壤(D)养分、酶活性和代表气候区差异的海拔(Alt)的Pearson相关性分析结果表明，两类土壤的受测指标相关性有明显差异。一方面，指标对的相关性性质在H和D之间并不完全一致。如，pH-TN、pH-AK、CAT-AP、Pho-TP等11组在H土壤中展现出正相关性，在D中则为负相关。另一方面，相关性性质相同的指标对的相关性强度在H和D之间也存在差异。如相对于H而言，呈正相关的pH-CAT、OM-Alt、CEC-Ure、TP-Alt和呈负相关的TN-CEC及TN-TP的相关性强度均在患病下增强，达到更高的显著性水平。可见，烟株根际土壤养分及酶活性之间的相关性性质及强度均在健康与患病处理间存在差异，整体而言，与健康烟株根际土壤相比，患病根际土壤CEC与其他指标的相关性增强，而Pho与其他指标的相关性减弱。此外，从海拔和各受测指标的相关性来看，相关性性质在健康土壤和患病土壤间并无差异，较为稳定，但相关性强度在二者间有一定差异，部分指标对受病害影响较为明显，如OM-Alt、CAT-Alt、Pho-Alt等。

2.4 土壤养分及酶活性的因子分析

利用土壤养分、酶活性及海拔共13个指标对健康和患病烟株根际土壤分别进行因子分析，按特征值大于1的原则两者均提取了4个主因子，方差累计贡献率分别能代表原信息总量的82.60%和79.21%(表3、表4)，具有较强的代表性。健康烟株根际土壤旋转因子载荷矩阵(表3)显示，该土壤Factor 1对方差的贡献率达27.53%，其中CEC、AP、Alt、pH值、Ure、TP的载荷值较高；Factor 2对方差的贡献率达25.64%，主要由载荷值较高的OM、TK、TN和Pho决定；Factor 3 对方差的贡献率是19.48%，主要影响指标为AK和CAT；Factor 4 对方差的贡献率为9.95%，仅AN 具有较高载荷。患病烟株根际土壤旋转因子载荷矩阵(表4)显示，Factor 1对方差的贡献率达28.00%，具有高载荷的指标有TP、Alt、TN、AP及CEC；Factor 2对方差的贡献率为24.37%，高载荷影响指标为Ure、TK、pH值、OM和CAT；Factor 3和Factor 4对方差的贡献率均在12%左右，前者高载荷影响指标仅有Pho，后者包括AN和AK。

右上角表示P值，*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；P>0.05无*，左下角表示相关性系数。Alt，海拔。

表3 健康烟株根际土壤因子方差贡献率及旋转因子载荷矩阵

表4 患病烟株根际土壤因子方差贡献率及旋转因子载荷矩阵

可见，尽管健康和患病烟株根际土壤养分和酶活性所提取的主因子数量相同，累积贡献率也相差不大，除Ure、pH值、Pho、AK、TN和CAT所属的主因子分类改变外，其余指标所属主因子均无变化，但各指标对主因子的载荷值在H和D之间有明显差异，如H土壤中CEC在Factor 1的载荷值为0.98，D土壤中则为0.70，CEC和Factor 1的相关性有所减弱。以上说明青枯病害的发生会明显影响土壤养分和酶活性对主因子的贡献情况，受测指标的贡献情况或可成为评定青枯病害发生与否的依据之一。

2.5 青枯病害烟株根际土壤养分及酶活性状况的判别分析

以12个土壤指标和海拔作为因子变量(X)、烟株患青枯病与否作为分类变量(Y)，进行Bayes逐步判别分析，得到5个判别能力较好的因子(表5)，即pH值(X1)、CEC(X3)、TN(X4)、AN(X5)和AK(X9)，构建判别某土壤上烟株是否具有患青枯病潜在性的模型如下：

表5 逐步判别函数系数表

Y1=0.328X1+1.725X3+16.995X4+0.128X5+0.054X9-39.387；

Y2=-5.270X1+3.233X3+25.353X4+0.227X5+0.091X9-69.265。

将原始数据带入模型进行自判别，结果显示，上述模型对健康和患病烟株土壤及总样本的判别准确率均达100%，具有较好的判别效果。

3 讨论

土壤养分及酶活性与植物的健康生长密不可分[20]。土壤有机质、有机氮含量偏高会使烟草青枯病更为严重[8]，桉树林地根际土壤有机质、全氮、全钾含量与青枯病的发病程度呈正相关关系[21]。本研究结果也显示，根际土壤的OM、CEC、TN、AN、TP、TK、AK较高和AP、pH值较低的烟株可能更易患青枯病害。这可能与患病烟株因养分过剩、植株软弱而易受机械损伤和病菌侵袭[22]，致使抗病能力降低有关。

尽管“品质元素”钾可以通过参与生理生化代谢过程加强组织结构而提高抗病性，但只有缺钾时施用钾肥才能抑制水稻的茎腐病，在不缺钾的情况下施用并无影响[23]，过量钾肥也会由于破坏养分平衡而影响作物生长[22]。本研究中患病处理的速效钾含量均远高于适宜的植烟土壤速效钾含量范围(150～220 mg·kg-1)[18]，TZ和KY地区的甚至超过400 mg·kg-1。与此同时，因子分析表明速效钾是第三或四主因子的高载荷因子，Bayes逐步判别分析与郑世燕等[9]的Fisher’s逐步判别分析也共同指出速效钾是重要的判别因子，说明土壤钾营养是判别烟株是否易患青枯病的关键因子。这在一定程度上反映出钾营养富足并未增强烟草对青枯病害的抗性，但究竟是钾富余引发的养分不平衡使烟草更易患青枯病，还是青枯病发生影响了根系吸收量而导致根际土壤中钾养分过剩，目前尚不可知，还需要进一步研究。

王贻鸿等[24]研究发现，偏酸性条件下青枯菌分泌的促进青枯菌与烟草根部的识别和吸附的胞外多糖增加，会进一步提高病害的发生率，而中性和偏碱性条件有利于脂多糖的分泌，降低病害发生。这可能是本研究中pH值较低时烟株更易患青枯病害的重要原因。此外，土壤酶活性的变化与作物土传病害的发生也有着紧密的联系。本研究酶活性结果显示，患病烟株根际土壤的脲酶活性和磷酸酶活性低于健康烟株根际土壤，与游春梅[25]关于三七根腐病与酶活性关系的研究结果基本一致。

土壤理化性质与酶活性各指标之间相互关联。土壤酶活性提高可以加快有机、无机营养物质的转化，促进碳、氮、磷等营养物质的循环[26-27]，从而影响土壤中营养元素的有效成分。健康和患病烟株根际土壤养分和酶活性的相关性分析表明，健康和患病处理的指标间相关性性质和密切程度存在显著差异，如健康处理下呈显著相关性的指标数量比患病处理的更多且相关性更强，健康处理下OM-Pho达显著正相关，但该指标在患病处理下未达显著相关。

因子分析结果显示，两处理根际土壤的同一养分或土壤酶所属的主因子有明显差异。一方面，土壤指标所属主因子改变的情况，如与健康烟株相比，患病烟株根际土壤Ure、pH值、Pho和AK所属主因子靠前，而TN和CAT则靠后；另一方面，即使土壤指标所属主因子类型不变，但指标的旋转因子载荷存在较大差异，如TP和CEC在H和D间的旋转因子载荷差值均达0.27左右。综上所述，本研究中根际土壤养分和土壤酶的相关性在健康和患青枯病烟株之间存在显著差异，根际土壤Ure、pH值及Pho偏低和CEC、TN、TP、AK含量及CAT活性偏高有可能更易促使烟草患青枯病。

气候对患病烟株和健康烟株根际土壤养分和酶活性的差异有明显影响，仅个别指标在某一气候类型下达到0.05显著性水平(图3)。本研究所选样点海拔跨度370～2 220 m，地势落差大，呈现出典型的立体气候特征[28]。海拔变化所引起的气候差异通过影响地表植被类型会引起土壤理化性质和酶活性的改变，对自然土壤而言通常表现为随着海拔的升高土壤养分含量和酶活性逐渐下降[29]，对耕作土壤而言因受人为施肥管理的影响，这一规律并不完全适用，如本研究中的有机质、全磷及3个土壤酶。整体而言，随着海拔的升高，气候区变化，烟株根际土壤养分和酶活性在健康与患病处理之间的差异在高海拔的亚热带季风性湿润气候下更为明显。

4 结论

患病烟株根际土壤和健康烟株根际土壤的养分和酶活性间均有着显著性差异。与健康烟株根际土壤相比，患病烟株根际土壤的pH值、有效磷和脲酶活性更低，而有机质、CEC、全氮、碱解氮、全磷、全钾、速效钾和过氧化氢酶活性更高，土壤养分及酶活性间呈正相关性的指标对更多且相关性更强。气候对患病烟株和健康烟株各指标之间的差异有明显影响，随着海拔的升高，呈升高趋势的患病烟株根际土壤养分和酶活性与健康之间的差异在高海拔的亚热带季风性湿润气候下愈发明显。根际土壤pH值、脲酶及磷酸酶活性偏低和CEC、全氮、全磷、速效钾含量及过氧化氢酶活性偏高有可能更易促使烟草患青枯病，因此调控根际营养平衡对提高土壤抑病能力、构建抑病型土壤具有重要作用，且在高海拔的亚热带季风性湿润气候下需加大调控力度。利用由pH值、CEC、全氮、碱解氮及速效钾作为判别因子所构建的判别模型可对未知植烟土壤上的烟株是否易患青枯病进行预测预报。