华东山茶花腐病病原菌分离鉴定

普梅英，武自强，张诗文，李艳杰，朱幼娇，吴 坤，陈龙清，王 超

(西南林业大学 国家林业和草原局西南风景园林工程技术研究中心，云南省功能性花卉资源及产业化技术工程研究中心，云南省森林灾害预警与控制实验室，云南 昆明 650224)

华东山茶(CamelliajaponicaL.)又名日本山茶，分布于中国山东半岛、浙江沿海、台湾北部，以及日本和朝鲜半岛南部，叶椭圆形，革质，边缘具锯齿，表面深绿色，叶背具褐色腺点，外轮花丝合生程度较高。其树形美观，花朵鲜艳，极具观赏价值，是优良的园林绿化树种，已成为世界流行的园林观赏树种[1]，也是我国十大名花之一[2]。华东山茶的花期从秋末开始，陆续绽放直至翌年春季，整个花期长达5个月，是冬季的主要观花种类[3]。山茶常见的病害有枝枯病、花腐病、炭疽病、花叶病、媒污病等[4-6]。随着山茶花栽植面积的扩大，山茶的花腐病肆虐，是全世界茶花观赏的一大难题[7]，是目前亟待解决的问题。有研究认为，山茶花腐病是由山茶叶杯菌(Ciboriniacamelliae)侵染所致[8-9]，也有研究认为，山茶花腐病是由山茶核盘菌(Sclerotiniacamelliae)和灰葡萄孢(Botrytiscinerea)侵染所致[10]，笔者先前也报道过假螺卷毛壳菌(Chaetomiumpseudocochliodes)导致云南山茶花腐病的发生[11]。前人对不同病原菌引起的山茶花花腐病进行了相关研究，但对于云南地区的华东山茶花花腐病研究还未见报道。笔者通过调查发现，昆明主要山茶园的花腐病发病率达65%以上，在云南楚雄紫溪山也存在严重的花腐病发生情况。本研究采集昆明植物园感病华东山茶花，通过组织分离、致病性验证、病原菌形态学和分子生物学，鉴定了该病害的病原种类，为华东山茶花腐病防治和抗病育种提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

植物材料：感病的华东山茶品种‘五彩’(Camelliajaponica‘Wucai’)于2021年1月7日采于云南省昆明植物山茶园(25°8′3.48″N，102°44′45.38″E)中，病株表现为部分花瓣出现不同程度的黄棕色且干腐或湿腐，甚至在花瓣基部长出菌丝体和子实体，直至侵染整朵花并掉落(图1-a、1-b)。

a，田间健康花症状；b，田间感病花症状；c，菌落；d，分生孢子；e、f，室内离体接种后花腐症状。

供试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂17 g，加水定容至1 000 mL。

1.2 病原菌的分离纯化

采用组织分离法[12]将花瓣放入75%乙醇30 s，用无菌水漂洗；再放入1%次氯酸钠30 s，用无菌水漂洗3次，放在灭菌滤纸上晾干；剪除花瓣上彻底病死的部分，剪取花瓣的病健交界处(5 mm × 5 mm或其他形状规则小块)，置于PDA表面，及时封口，并做标记，重复3次。倒置装入自封袋，放于25 ℃恒温培养箱中培养3～7 d，每天观察是否长出菌丝，是否污染，并拍照作好记录，待长出真菌菌丝后，进行分离纯化。

1.3 致病性测定

在真菌菌落边缘，用5 mm打孔器打取菌饼。用无菌接种划伤山茶花瓣，在伤口上放置菌饼(气生菌丝面向伤口)，以放置无菌PDA做空白对照，重复3次。接种后用沾无菌水的棉花保湿培养诱导发病。每日拍照并记录描述花朵状态[13]。

1.4 形态学鉴定

将纯化后得到的菌株转接到PDA培养基上，于25 ℃培养箱中培养7 d，记录菌落特征(正反面颜色、形状、质地等)。待产生分生孢子后，显微镜下观察产孢结构，以及分生孢子形状和大小，并拍照记录[14-16]。

1.5 分子生物学鉴定

采用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒进行DNA提取，利用引物ITS1和ITS4、NL1和NL4、BT-2A和BT-2B(表1)进行PCR反应，分别获取内部转录间隔区(ITS)区间、核糖体大亚基(LSU)区间、微管蛋白(β-tubulin)区间的DNA序列。

表1 引物序列

采用1.0%琼脂糖电泳检测PCR产物，并进行双向测序，测序结果登陆NCBI网站进行BLAST比对来确定致病菌的种属类别。利用MEGA 6.0邻接法(Neighbor-joining，NJ)多引物合并构建系统发育树，确定病原菌的种类。

2 结果与分析

2.1 病原菌的致病性

将从昆明植物园采集的华东山茶品种‘五彩’样品上分离得到的2株疑似病原菌(23h和23b)回接到华东山茶品种‘五彩’的健康花瓣上，接种后3～5 d，接种菌株23h的华东山茶品种‘五彩’花瓣上呈现病症，并长出子实体；回接花瓣开始发黄湿腐，尤其是划破的病症更为明显，从伤口处向外扩展，直至侵染整片花瓣，与所采集的病症一致(图1-e、1-f)。

2.2 病原菌的形态学

(25±1)℃培养7 d，菌株23h的菌落直径为(9±1)cm，菌丝白色，后期长黑色的分生孢子(图1-c)。菌株23h在PDA培养基上的分生孢子呈柄状、球状到棍棒状，单生或聚集，黑色，直径200～400 μm；分生孢子梗透明，具隔，不规则分枝，长可达100 μm；分生孢子囊圆柱形，透明，光滑，(10～60)μm ×(4～12)μm(图1-d)，该结果与文献[21]结果一致。

2.3 病原菌的分子生物学鉴定

利用真菌ITS、LSU、β-tubulin序列引物扩增分离菌23h的r DNA-ITS区间、LSU区间、β-tubulin区间序列，1.0%琼脂糖电泳成像检测(图2)表明，扩增条带为500～750 bp。对扩增条带测序后，在NCBI的GenBank进行Blast比对，分离菌株23h与已知模式属的最大相似性在98%以上，说明新分离菌株的科学分类地位比较明确，且获得序列登录号OL763557 (ITS)、OL763450 (LSU)、OL848463 (β-tubulin)。

a、b、c为引物ITS、LSU、β-tubulin序列的电泳图；M为DL2000 marker.

利用MEGA 6.0的邻接法(NJ)合并构建系统发育树，结果表明，菌株23h与葡萄牙拟盘多毛孢(Pestalotiopsisportugallica)聚集在同一分支上(图3)，多基因系统学分析结果进一步证实了云南省昆明市昆明植物园华东山茶花腐病的病原菌为葡萄牙拟盘多毛孢(P.portugallica)。

图3 基于ITS、LSU和β-tubulin序列的菌株23h多基因系统发育进化树

3 结论与讨论

拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)是Steyaert建立的，该属真菌的子实体通常为分生孢子盘类型，以全壁芽殖环痕型方式产孢，分生孢子5细胞，中间3个色胞，具真隔膜，分生孢子顶端常具2根以上附属丝，基部常具1根附属丝[22]。拟盘多毛孢菌属真菌侵染的寄主种类多、范围广，可引起多种经济作物和观赏植物的多类病害，病征具有多样性。可侵染芒果[23]、杨梅[24]、蓝莓[25]等，引起叶枯、叶斑、腐烂、溃疡等[26-27]。张凡等[28]对采自南京中山植物园和周边地区的落羽杉病叶进行分离鉴定，结合形态特征与分子鉴定最终确定落羽杉赤枯病病原菌为斑污拟盘多毛孢(Pestalotiopsimaculans)。陈立杰等[29]从花溪区黔陶乡赵司村的茶树叶片上分离到2株拟盘多毛孢属真菌，综合形态学观察与DNA序列分析，所分离的真菌属于拟盘多毛孢属的一个新种，将该种命名为中国茶拟盘多毛孢(Pestalotiopsicamellia-sinensis)。何翔等[30]报道稻曲拟盘多毛孢(Pestalotiopsioryzae)可侵染滇重楼植株，引起真菌性叶斑病。秦绍钊等[31]从油茶中分离得到木防已拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsicocculi)，在油茶叶枯病的相关研究中属于首次报道。葡萄牙拟盘多毛孢菌(P.portugallica)已被报道导致贵州六盘水山茶黑斑病[32]，近些年关于该菌的报道甚少。综上，拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)真菌确能引起多种植物真菌病害的发生，葡萄牙拟盘多毛孢菌(P.portugallica)也确能引起山茶病害的发生，且同一种病原菌可能会引起同种植物的不同病害发生，这将为进一步的研究提供参考。

通过对昆明植物园华东山茶品种‘五彩’的感病花瓣进行分离鉴定，结合致病性测定、形态学和分子生物学鉴定结果，确定引起华东山茶花腐病的病原菌为葡萄牙拟盘多毛孢菌。本研究分离得到的华东山茶花腐病病原菌与前人报道的病原菌不一致，这些病原菌是否存在协同侵染，有待进一步验证。本研究结果可以为华东山茶花腐病的生物防治提供参考。