‘黑皇’葡萄组织培养技术

邢博闻 张慧婷 姜亮 孙宇红 王能 王赟 赵韵

（1 上海市闵行区农产品安全质量检测中心，上海 201109；2 上海市闵行区三农综合服务中心, 上海 201109）

‘黑皇’葡萄是由‘巨峰’葡萄和‘贝蕾A’葡萄杂交育成的3 倍体后代，果实天然无籽、呈球形、直径可达到6 cm，果皮较薄、呈紫红色、表面覆盖有白色粉末、易剥落，果肉厚实多汁、粒绿色、糖度高（甜度在22°左右）、带有‘巨峰’葡萄的麝香气味。由于‘黑皇’葡萄的植株生长速度较快，坐果率高，果实品质较高，具有较好的丰产稳产性能[1]，在其生长过程中不用进行疏粒处理，可节省较多人工，果实硬度较高，适合长途运输且能长时间储存，故近年来，上海地区开始引种栽培‘黑皇’葡萄替代‘巨峰’葡萄。

目前，葡萄苗木主要采用扦插、嫁接和组织培养技术进行繁殖，其中应用组织培养技术可以快速、规模化繁殖获得无菌脱毒种苗。同时，近年来，葡萄组织培养技术已经取得较大进展，例如‘巨峰’[2]、‘阳光玫瑰’[3-4]等主栽葡萄品种的组织培养已取得成功[5]，但目前未见有关‘黑皇’葡萄组织培养的研究报道。在此背景下，为了促进‘黑皇’葡萄的推广应用，笔者进行了‘黑皇’葡萄的嫩茎培养及组培快繁技术研究，最终集成了‘黑皇’葡萄组织培养技术。现将总结出的‘黑皇’葡萄组织培养技术报道如下，以期实现‘黑皇’葡萄种苗规模化生产。

1 外植体的选择及表面消毒

外植体选择是组培体系成功建立的第1步。根据现有的研究报道，葡萄的外植体一般采用嫩茎或新梢[6-7]，也可采用冬季休眠梢[8]。‘黑皇’葡萄的组织培养宜采用春季萌发的幼嫩新梢作为外植体，这是因为新梢生长旺盛、携带细菌的概率低，且在温度较低的春季进行取材，外植体表面消毒较容易，有利于腋芽萌发，从而可以显著提高诱导的成功率。具体操作步骤为：在新梢长至10 cm 左右长度时，将新梢连同叶片一起剪下，然后去除叶片和叶柄，将嫩梢剪成长度在5 cm 左右的茎段；茎段用自来水冲洗30 min 后，转入超净工作台，用75%酒精浸泡1 min，再用无菌水冲洗1 遍，然后用10%次氯酸钠溶液或0.1%升汞溶液浸泡10～15 min（期间不断摇晃瓶子，使消毒液和茎段充分接触），最后用无菌蒸馏水冲洗5 遍（每遍5 min 左右）；茎段经消毒后，置于无菌滤纸上，吸干外植体表面多余水分，即可接种于腋芽启动培养基。

2 腋芽启动培养

腋芽启动培养是诱导葡萄休眠腋芽形成新植株的过程，需要配合使用细胞分裂素和生长素。适合‘黑皇’葡萄腋芽启动培养的最佳培养基配方为WPM+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.05 mg/L+ 蔗糖20 g/L+琼脂粉6.5 g/L，pH 调至5.75～5.85，采用该培养基进行腋芽启动培养，大部分茎段可萌发出新芽，仅少部分茎段会出现褐化。具体操作步骤为：先将培养基置于高温高压 (121 ℃，103～107 kPa)条件下灭菌20 min，然后分装于带有透气膜瓶盖的组培瓶；将消毒好的‘黑皇’葡萄外植体剪成带1 个腋芽的茎段，然后将其接种于腋芽启动培养基上，每瓶接种5 个外植体；将接种好的组培瓶置于光照培养室进行培养，培养温度为25 ℃，光照强度为1 500 lx，光照周期（光暗比）为16 h∶8 h；培养1 周后，将已污染的外植体舍弃，余下的继续培养，约10 d 后即可观察到腋芽生长点开始萌动、新叶逐渐展开、形成新梢。值得注意的是，外植体培养过程中，在茎基部会有少量白色愈伤组织发生。

3 不定芽增殖培养

在腋芽萌发的枝条长度超过1 cm 时，即可将其转接到增殖培养基上。葡萄为藤本植物，增殖培养可采用无菌短枝扦插的方式，即将植株剪成带1 个腋芽的茎段后，转接到继代培养基上进行增殖培养。但是，在‘黑皇’葡萄进行增殖培养过程中，植株茎干和叶片容易发生褐变，导致叶片脱落，使植株进入休眠状态，从而降低增殖效率，故需在培养基中添加Ca(NO3)2，以缓解茎段褐化及叶片凋落。根据试验结果，适用于‘黑皇’葡萄的最佳增殖培养基配方为WPM+Ca(NO3)20.5 g/L+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.3 mg/L+ 蔗糖20 g/L+ 琼脂粉6.5 g/L，pH 调至5.75～5.85，培养基的分装和灭菌方法同2。增殖培养的温度为25 ℃，光照强度为1 500 lx，光照周期（光暗比）为16 h∶8 h。每2 个月即可继代增殖培养1 次，增殖系数可达5.2 左右。

4 植株生根培养

‘黑皇’葡萄的生根培养较容易，在培养基中添加IBA 可有效促进‘黑皇’葡萄的根系诱导及生长。将增殖培养的葡萄嫩茎剪成带1 个腋芽的茎段，然后将其转接于生根培养基即可进行生根培养。最佳生根培养基配方为1/2MS+IBA 0.5 mg/L+ 活性炭0.2 g/L+ 蔗糖20 g/L+ 琼脂粉6.5 g/L，pH调至5.75～5.85。生根培养的温度为25 ℃，光照强度1 500 lx，光照周期（光暗比）为16 h∶8 h。培养1个月后，植株即可生根，且大部分植株的根系为白色、生长良好，植株长势旺盛。

5 试管苗移栽驯化

将生根良好的试管苗转移到室温条件下放置7 d，然后打开瓶盖继续放置2 d；取出植株，用自来水将试管苗根部的培养基冲洗干净后，将试管苗移栽到装有基质的50孔穴盘中[研究表明，最适宜‘黑皇’葡萄试管苗移栽驯化的基质配方为草炭∶蛭石∶珍珠岩=3∶1∶1（体积比）。移栽前需用0.1%多菌灵浇灌基质1次，进行消毒] ；试管苗移栽入穴盘后，放置于覆盖塑料薄膜的拱棚中，保持棚内湿度在90%以上、温度为20～30 ℃，且每天喷雾浇水2次；试管苗移栽7 d 后，将拱棚两端的薄膜掀开，每天喷雾浇水1 次，且每隔7 d 喷洒0.1%代森锰锌溶液1 次；1 个月后，驯化完成，将薄膜彻底掀开，将驯化成活的‘黑皇’葡萄植株移栽到花盆中（移栽成活率可达90%以上），进行常规水肥管理即可。

6 结论与讨论

本研究通过应用组织培养技术，实现了‘黑皇’葡萄种苗的规模化快速繁殖。具体方法为：采用春季萌发的新梢作为外植体，通过嫩茎离体培养诱导腋芽萌发，对新芽采用无菌短枝扦插的方式进行增殖扩繁，最后诱导茎段生根形成完整的‘黑皇’葡萄植株。

值得注意的是，笔者在研究过程中发现，细胞分裂素6-BA 对‘黑皇’葡萄的腋芽启动和增殖培养具有促进作用，且低浓度的6-BA 有利于腋芽的启动萌发，但当6-BA 浓度高于1.5 mg/L 时，容易形成愈伤组织，阻碍腋芽生长。