近亲结婚1家系Leber先天性黑矇TULP1基因新突变

房心荷，朱德军，邹文青，朱金燕

Leber先天性黑矇(LCA)是一种严重致盲性遗传性视网膜疾病，遗传性视网膜疾病中Leber先天性黑矇占比5%，是导致儿童先天性早发性盲的首要疾病[1]。Leber先天性黑矇多表现为常染色体隐性遗传，临床表现分为婴儿型和少年型，主要以眼球震颤、固视障碍、指压症阳性为特征，ERG表现为明视暗视中重度降低甚至呈熄灭型，具有诊断意义[2]，部分患者可伴有小眼球、圆锥角膜、身体智力发育迟缓等综合征表现。本病为单基因遗传眼病，近年来相继发现了20余个致病基因可导致Leber先天性黑矇发病[3]，各种视网膜功能相关基因突变引起蛋白、细胞结构功能异常而导致视功能严重丧失[4]。国际罕见病研究联盟(IRDiRC)在其愿景中指出，到2020年，所有遗传疾病患者都应得到分子诊断[5]。本研究对1个近亲结婚Leber先天性黑矇家系先证者及家庭成员进行基因检测，旨在明确分子诊断，综合分析临床表型与基因型，提高临床诊断和基因诊断水平，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料：收集在宁夏回族自治区人民医院眼科就诊的近亲结婚Leber先天性黑矇家系共4人(1个先证者及其正常父母、姐姐)作为研究对象。先证者及其家庭成员均行裸眼视力、最佳矫正视力、裂隙灯显微镜、裂隙灯下前置镜、眼压、彩色眼底照相、视野、光相干断层扫描(OCT)以及全视野视网膜电图(ERG)和荧光素眼底血管造影(FFA)检查。记录先证者及其家庭成员家族史、婚育史以及全身疾病史，绘制家系图。本研究所涉内容遵照赫尔辛基宣言，被纳入研究的未成年患儿监护人均被告知研究目的及内容，签署由宁夏回族自治区人民医院伦理委员会准许制定的知情同意书(2016018)。

1.2 Leber先天性黑矇临床诊断标准[6-7]：①6月龄以下视力严重损害或盲、伴有固视障碍、眼球震颤或指压眼球等症状的患儿；②视网膜电图示a、b 波严重降低，甚至呈熄灭型；③视网膜弥漫色素颗粒沉积，呈骨细胞样或椒盐样改变。

1.3 方法

1.3.1 全基因组外显子测序：采集Leber先天性黑矇患者及其家庭成员外周抗凝血6mL，利用Qiamp DNA Blood MiniKit(NO.51106)试剂盒(德国QIAGEN公司)提取基因组DNA。行全基因组外显子捕获(Agilent SureSelect外显子捕获试剂盒)，采用高通量测序仪 (Illumina)测序且深度达到100×。原始测序数据经过Illumina basecalling Software 1.7分析软件处理后与NCBI人类基因组DNA参照序列(NCBI build 37.1)进行比对。采用SOAP软件(http://soap.genomics.org.cn)分析单核苷酸变异(SNV) 相关信息，采用BWA软件 (http:// bio-bwa.sourceforge.net/)分析插入和缺失变异(Indel)相关信息，获得全部变异位点。滤除数据库(db135)常见变异(MAF>1%)及对蛋白质功能和结构无影响的变异。经过逐步过滤，筛选出家系内所有先证者共享的变异数，再过滤家系无患病亲属存在的变异，获得候选致病基因变异。利用Sanger测序技术验证得到致病性突变位点，确保在正常家系成员中呈现共分离。

1.3.2 基因变异致病性分析：利用HGMD(human gene mutation database)、dbSNP(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)等数据库工具对目标突变位点进行查询，在HGMD中查看是否为已报道致病突变，是否已被收录。如果是未报道过的新变异，依据美国医学遗传学与基因组学学会 (ACMG) 2015年发布的《序列变异解读标准和指南》对新发变异进行基因变异致病性评估。将变异位点放至正常人数据库进行过滤筛选，包括正常人群频率1000 Genomes (http://browser.1000genomes.org)及ExAC(http://exac.broadinstitute.org/)数据库。在Poly Phen2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2)、MutationTaster (http://www.mutationtaster.org)等网站上预测变异位点对蛋白功能的影响。运用GERP++ (https://bio.tools/gerp)等网站衡量进化中跨物种基因序列的保守情况。PolyPhen2预测软件对突变位点预测值范围为0～1，分值越高越有害。Mutation Taster预测软件对突变位点预测值范围为0～1，分值越高越有害。氨基酸序列保守性GERP++预测值范围大于2表示比较保守，GERP分数高意味着序列高度保守，因此改变是有害的。

2 结果

2.1 临床特征分析：患者，男，11岁，出生后即出现双眼球轻度震颤，视力低下。色觉检查为全色盲。裸眼视力右眼0.25、左眼0.12，1%阿托品散瞳验光右眼-1.50DS/-0.50DC×150°：0.25，左眼-1.00DS/-1.50DC×175°：0.12，即双眼矫正视力不提高。双眼前节未见异常。双眼视盘色淡、边界清，血管纤细，视网膜内未见明显色素沉积。双眼黄斑OCT示黄斑形态正常，层系间分明、清晰可辨。眼底自发荧光未见明显异常。进行ERG检查，暗适应0.01ERG：b波重度下降；暗适应3.0ERG：a、b波均呈熄灭型；暗适应3.0震荡电位：右眼重度下降，左眼中度下降。明适应3.0ERG，a波：右眼呈熄灭型，左眼重度下降；b波：右眼呈熄灭型，左眼重度下降；明适应3.0闪光ERG:呈熄灭型。先证者父母为近亲结婚，其父母裸眼视力均达1.0及以上，双眼前节及眼底检查未见异常，全视网膜电流图正常。

2.2 全基因组外显子测序结果:利用全基因组外显子测序及PCR验证，先证者为TULP1基因的纯合错义突变c.C1024G(p.R342G)。表型正常的父亲、母亲及姐姐均携带一个c.C1024G杂合突变，提示基因型和表型共分离,符合常染色体隐性遗传方式。

2.3 生物信息学分析：基因检测在先证者TULP1基因第11号外显子检测到纯和错义突变c.C1024G(p.R342G)，编码区第1024位的核苷酸C(胞嘧啶)变异为G(鸟嘌呤)，变异导致编码蛋白序列内的氨基酸改变p.R342G，第342号氨基酸由精氨酸(Arg)变异为甘氨酸(Gly)。该变异此前在文献中未见报道，在1000基因组数据库(1000 Genomes Database)和东亚人口数据库(ExAC_EAS)的搜索结果显示，这个变异的突变频率均为0(PM2_Supporting)，是新发现的变异位点。通过预测软件分析变异对蛋白功能的影响，PolyPhen2 评分为0.9571，表明为有害，MutationTaster 评分为D，表明为有害，见表1。保守性分析发现TULP1基因第342位精氨酸，在人、猩猩、小鼠、野牛中高度保守。根据中国遗传学会遗传咨询分会《ACMG遗传变异分类标准中文版专家共识指南》，错义突变评为PVS1，数据库中未发现该变异评为PM2，符合家系共分离评为PP1，该突变总致病性评分均为PVS1+PM2+PP1，为致病性变异。

表1 不同软件分析TULP1变异对其蛋白功能的影响

3 讨论

Leber先天性黑矇是严重危害儿童视网膜疾病，可导致部分患儿失明，其发病率为1∶81 000～1∶30 000[8]，患儿多于出生时或6月龄内即出现视力低下、无固视、眼球震颤、指压征、眼球内陷等。指压征为用手指多次用力按压眼球，可能与此动作产生的闪光感及幻视使患儿得到较多光刺激有关，具体的分子机制尚不明确。这种动作持续按压眼球，导致眶周脂肪萎缩并眼窝凹陷。眼底表现既可完全正常，也可表现为黄斑牛眼样外观、后极部灰白色斑点改变等，部分病例直到病变晚期仍保持正常眼底外观[9]。ERG表现为熄灭型或者明视暗视反应重度下降，具有诊断意义。Leber先天性黑矇临床表现复杂，症状及体征特异性不强，其他综合征或非综合征眼病也可有相似表现，临床上容易误诊为全色盲、不完全色盲、先天性静止性夜盲、白化病和视神经发育不全等[10]。Leber先天性黑矇多表现为常染色体隐性遗传，也有显性遗传及X连锁性遗传报道。Leber先天性黑矇具备临床表型多样性及遗传异质性的特点，主要表现为不同的等位基因或者基因突变可引起相似的临床表现，但有些相同的基因突变，发生在不同家系或不同位点时可有不同的临床表现[11]。

目前，有20余个与Leber先天性黑矇相关的致病基因被公布，分别涉及视网膜内维生素 A 的代谢循环、光感受器纤毛转运过程、视网膜光电信号的传导过程、视网膜光感受器细胞的分化和发育以及蛋白转运和分布等[12]。遗传类疾病的致病基因在不同人种及地域存在很大差别，Eisenberger T[13]等对欧洲人群中部分Leber先天性黑矇患者进行研究发现，TULP1基因突变可致10.7%患者发病。亚洲人群中TULP1基因突变导致Leber先天性黑矇报道较少，Li等[14]对87位中国患者基因筛查结果显示排名前五位的分别为GUCY2D、CRB1、RPGRIPI、RPE65、SPATA7。2016年盛迅伦[15]等发现一个导致Leber先天性黑矇的新的突变基因CCT2，也是一个涉及光感受器连接纤毛转运过程的基因。

TULP1基因(TUB Like Protein 1)定位于6p21.31，由542个氨基酸(61kDa)构成TUB样蛋白1，是非综合征型视网膜纤毛疾病相关基因，主要在视网膜光感受器细胞表达，光感受器细胞通过突触与内视网膜进行交流，TULP1在光感受器突触前末端的活性区表达最丰富，对于视紫红质在光感受器内外节之间的分布转运具有重要作用。TULP1基因变异可导致LCA15型和RP14型[16]。LCA 15型有Leber先天性黑矇的一般特点，疾病严重程度较轻，但发病年龄早、表型严重于视网膜色素变性。与遗传性视网膜疾病相关的TULP1突变至少有59种[17]，本研究中错义突变c.C1024G(p.R342G)未见文献报道，该突变在正常千人汉族人群及千人东亚人群中的突变频率为0，是新发现的突变位点。家系中先证者父母亲(I1、I2)及姐姐(II1)均携带一个TULP1杂合突变c.C1024G，表型正常，表明TULP1纯和错义突变为本家系的致病原因，结合病史及眼科相关检查综合判断为LCA15型(MIM：613843)的可能性大。有研究表明TULP1基因突变是与早发型视网膜色素变性有关的一个基因，但国内暂无TULP1基因突变与无色素性视网膜色素变性有关的报道，提示TULP1基因不同的变异位点可能存在不同致病机制，导致临床表型不同的疾病。具体机制仍需进一步探索。

本研究从Leber先天性黑矇的临床表现和遗传变异水平阐明了1个近亲结婚家系患者的致病原因，报道了导致Leber先天性黑矇的新发变异。进一步扩充了Leber先天性黑矇的突变位点，扩大了Leber先天性黑矇的基因突变频谱，使该病的分子病理机制得到了进一步理解，为LCA的精确诊断、遗传咨询和产前诊断以及可能的基因治疗提供了理论依据。同时也说明全基因组外显子测序技术对此类疾病具有重要的辅助诊断意义。