枸杞多糖促进压疮大鼠皮肤创面愈合的作用机制研究

韩凤玉，闫凤华，张俊飞，马亮亮，王丽凤

压疮(PU)是由于局部组织长期受压，继而发生持续性缺血、缺氧及营养不良，从而导致组织发生了溃烂和坏死的疾病[1]。PU经久不愈，延长了患者住院时间，给患者及家庭带来严重的经济负担，此外，PU持续发展累及深部组织继发感染后引起脓毒症等会危及患者生命[2]。欧美等国家研究指出PU已经是继癌症和心血管疾病之后医疗花费最高的疾病[2]。随着中国老龄化发展PU患者也越来越多，这给患者及家庭带来了沉重的负担。目前关于PU的治疗主要包括药物疗法、手术、电刺激、封闭负压引流疗法和红外线光疗等方法[3]。相比于手术等西医治疗方案，中医药外用膏剂、散剂、煎剂、艾灸、针灸和内服药物等方法在治疗PU方面也取得了很好的效果，并且患者治疗费用和接受度更高[4]。产自宁夏的地区的枸杞是我国传统名贵中药之一，现代研究发现枸杞中提取的多种天然化合物具有多种药理活性，其中枸杞多糖(LBP)因具有抗氧化，抗衰老，抗肿瘤及免疫调节等多种药理作用备受关注[5]。同时研究发现LBP在治疗皮肤损伤和溃疡中都表现出良好化学活性[6]。但是LBP对PU治疗的作用机制依然不清，因此，本研究拟通过局部缺血再灌注损伤构建PU大鼠模型，探讨LBP促进创面愈合的可能机制，从而为LBP临床治疗PU提供依据。

1 资料与方法

1.1 主要仪器与试剂:枸杞多糖(纯度：50%，批号MCA2016157)、ELISA试剂盒[IL-6(批号P1042)、IL-1β(批号P1037)、TNFα(批号P1003)和VEGF(批号P1012)]购于上海善然生物科技有限公司；多聚甲醛(粉末，纯度大于95%)购于美国Sigma公司(批号158127)； IL-6、TNFα、VEGF和β-actin引物由上海英杰生物科技有限公司设计合成。BeyoFastTMSYBR Green One-Step qRT-PCR(批号D7268S)、总RNA抽提试剂(批号R0011)、RIPA裂解液(批号P0013B)购买碧云天生物技术公司。实时定量Agilent PCR 仪购于美国安捷伦科技公司。

1.2 实验动物:SPF级雄性Wistar大鼠[(SCXK(宁)2015-0001)]50只，6～8周龄。实验通过宁夏医科大学总医院伦理委员会批准(2020-096)，严格按照实验动物的护理和使用规定进行动物研究。

1.3 方法

1.3.1 动物模型制备:10%水合氯醛(0.3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，将其背部皮肤剃毛至表面无毛发，备皮区域面积约为10 cm×5 cm。将其背部皮肤(松软)沿正中线提起，对称性扣上强力磁铁(直径25 mm,圆形)，靠磁铁的强大磁力作用对其进行压力损伤，造成压迫缺血，采用夹(缺血)12h再松(灌注)12 h，连续3循环的造模方法对大鼠的皮肤造成损伤制备PU模型[4]。

1.3.2 分组和给药:将大鼠随机分为五组，每组6只大鼠。对照组、模型组、治疗组(高、中、低剂量)。模型组和治疗组大鼠采用模型制备方法进行PU模型制备。将枸杞多糖粉末溶于生理盐水配制成枸杞多糖溶液，高剂量组按照[100 mg/(kg·d)]，中剂量为[75 mg/(kg·d)]，低剂量按照[50 mg/(kg·d)]剂量连续灌胃干预2周。对照组和模型组采用同等体积生理盐水给予连续灌胃2周。实验执行期间所有实验动物均正常饮水饮食。末次给药后12 h 10%水合氯醛(0.3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠后进行组织取材，取材后采用颈椎脱位处死大鼠。

1.4 观察指标

1.4.1 创面愈合率的测定：参考高翔[7]等研究方法进行大鼠PU创面愈合率计算[愈合率=(造模后PU面积-治疗后PU面积)/造模后PU面积×100%]。通过Image J软件进行辅助计算。

1.4.2 ELISA检测：大鼠麻醉后,通过腹主动脉对各组大鼠进行血液采集，离心保存血清后按照ELISA试剂盒说明书分别进行IL-6、IL-1β、TNFα和VEGF水平检测。

1.4.3 逆转录定量聚合酶链反应(RT - qPCR)检测：对各组大鼠PU创面皮肤组织进行取材后，参考于泽洋[11]等研究方法进行，主要包括提取组织中总RNA后按照相关操作试剂盒进行cDNA合成，最后采用荧光定量PCR试剂盒在反应条件下进行PCR检测。相对表达水平采用2-ΔΔCt分析方法测定，各基因引物序列见表1。

表1 基因引物

1.5 统计学方法:所有数据以“Mean±SD”表示，采用SPSS 21.0软件进行统计学分析，采用单因素方差分析分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LBP对PU大鼠创面愈合的影响:与模型组相比，LBP对PU大鼠创面均具有很好的治疗效果，随着剂量增加创面愈合率也明显提高，具有一定的剂量依赖性，差异具有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 LBP对PU大鼠创面愈合率的影响

2.2 LBP对PU大鼠血清TNFα、IL-6、IL-1β和VEGF水平的影响:LBP对PU大鼠治疗后可以明显降低血清TNFα、IL-6和IL-1β水平，随着剂量增加降低效果明显提高，具有一定的剂量依赖性，差异具有统计学意义(P<0.05)。同时与模型组相比，LBP提高了PU大鼠血清VEGF水平并随着剂量增加VEGF表达水平也逐渐提高，具有一定剂量依赖性，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 LBP对PU大鼠血清TNFα、IL-6、IL-1β和VEGF水平的影响

2.3 LBP对PU大鼠皮肤创面组织中TNFα 、IL-6和VEGF的mRNA表达的影响:与模型组相比，LBP治疗后PU大鼠创面组织中TNFα mRNA和IL-6 mRNA表达水平明显下降并随着LBP剂量增加而下降，具有剂量依赖性，差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，LBP治疗后PU大鼠创面组织中VEGF mRNA表达水平明显升高并随着LBP剂量增加而升高，具有剂量依赖性，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图1(封二)。

3 讨论

PU又称为压力性溃疡，目前对其定义中明确提出了“三力学说”即压力、剪切力、摩擦力，各因素可单独或复合存在作用。虽然PU的具体发病机制依然不清，但是目前主要认为其与皮肤缺血损伤、缺血再灌注损伤、代谢障碍和细胞变形等机制相关[2]。其中缺血再灌注损伤在PU的发生机制中受到了越来越多的关注，本文前期研究与其他人研究都采用缺血再灌注损伤方法进行了模型制备，病理结果显示模型稳定可靠，为后续研究提供了保障[4]。对于PU创面治疗中，损伤皮肤组织的治愈率是判断药物治疗成功的主要指标之一，本研究中通过给予LBP连续治疗后，与模型组相比，PU大鼠创面愈合率明显提高，并在本文所用剂量范围内，随LBP剂量增高，愈合率增高越明显，具有剂量依赖性。研究结果与其他中医药治疗方法接近[7]。在创面修复过程中VEGF被认为发挥重要作用，它可以促进血管内皮细胞有丝分裂，诱导微血管通透性增强，导致血浆蛋白广泛渗漏，包括纤维蛋白原、纤溶酶原和纤维蛋白等。这些蛋白质直接或间接地改变细胞外主要成分，形成临时的新基质来支持内皮细胞和成纤维细胞的迁移，从而促进伤口愈合[8]。在慢性创面伤口中VEGF表达水平下调，导致血管生成速率下降，降低了组织修复能力[9]。本研究中，给予LBP治疗后PU大鼠血清和创面组织中VEGF表达水平都高于模型组，并随LBP剂量增高，VEGF水平增高越明显，具有剂量依赖性。我们的结果与Zhou[10]等研究相近。

有研究表明，在PU的创面中炎症介质大量产生后会破坏组织完整性相关的酶，使创面细胞基质和纤维连接蛋白降解，从而使创面经久不愈。汪涟[10]等对压疮患者的组织样本进行检测，结果表明IL-1β、IL-6和TNFα的mRNA表达明显高于正常对照组，表明炎症因子在压疮发生中扮演着重要角色。易倩[11]等采用湿润烧伤膏联合银离子抗菌敷料对压疮患者创面进行治疗后取得满意效果，提高了创面治愈率，并且降低了压疮患者血清IL-6、IL-8、TNFα及hs-CRP的表达，表明降低炎症因子是提供创面愈合的有效手段。戢艳琼[12]等研究发现瑰及乳膏可以通过抑制压疮创面炎症介质IL-6、IL-1β引起的炎症反应来减轻创面损伤，并提高BFGF及FN的合成来促进间质细胞的增殖和细胞外基质的合成，从而促进创面肉芽组织新生而加速创面组织修复。本研究也表明，LBP可以有效降低PU大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNFα表达水平并具有剂量依赖性，同时对创面组织中IL-6和TNFα的mRNA表达水平进行了检测，结果显示LBP可以降低组织中IL-6和TNFα的mRNA表达水平并具有剂量依赖性，结果与血清中表达相一致。这表明LBP对PU大鼠创面损伤具有很好的抗炎作用。

中药具有多成分、多靶点、多途径的特点，LBP作为枸杞主要成分已经被证明具有多种药理活性。在我们的研究中发现LBP在PU大鼠创面愈合过程中发挥了明显的抗炎作用并促进了血管内皮生长因子的表达，为创面修复提供了良好的内环境。