TpbA通过调节c-di-GMP抑制鲍曼不动杆菌ATCC17978生物膜的形成

张玉英，黄 菱，赵建宁，师志云

鲍曼不动杆菌(AB)是一类非发酵、氧化酶阴性的革兰阴性杆菌，属条件性致病菌，可引起呼吸道感染、泌尿系感染、败血症或继发性脑膜炎等,其中呼吸机相关肺炎和血液感染的死亡率可达35%[1]。鲍曼不动杆菌耐药的重要机制之一是形成生物膜。而鲍曼不动杆菌生物膜形成的关键是广泛存在于细菌中的一种核酸类第二信使 3,5-环鸟苷二磷酸(c-di-GMP)。c-di-GMP的浓度水平主要是由具有合成活性的二鸟苷酸环化酶(DGC)和降解活性的磷酸二酯酶(PDE)控制的。生物膜形成相关的酪氨酸磷酸酶A(pbA)是铜绿假单胞菌中新发现的一种作用于c-di-GMP的磷酸二酯酶，更重要的是TpbA在鲍曼不动杆菌中存在高度保守基因序列[2]。TpbA可能通过调控c-di-GMP进而影响鲍曼不动杆菌ATCC17978生物膜的形成。目前，国内外尚未发现相关研究，本研究旨在为寻找针对生物膜的新靶点提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般材料:鲍曼不动杆菌ATCC17978(美国ATCC中国代理北京中源合聚生物科技有限公司);小鼠抗-TpbA的单克隆抗体(BD公司)；基因合成由上海生工完成；pET-28a载体为本实验室的原有保藏；EcoRⅠ、NotⅠ、IPTG、大肠杆菌BL21感受态购自北京全式金公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG抗体购自北京中杉金桥公司；His亲和层析柱购自美国GE公司；c-di-GMP特异性抗体购自美国Abcam公司；全自动分光光度仪为美国Thermo公司产品；酪氨酸磷酸化酶活性试剂盒(Promega公司)；96孔微量培养板(Thermo公司)，其他常规耗材与试剂均为国产。

1.2 研究方法

1.2.1 TpbA基因合成：上海生工合成TpbA基因序列，引入限制性内切酶EcoR Ⅰ和Not Ⅰ。

1.2.2 TpbA基因载体的构建：在大肠杆菌BL21中，将该基因克隆至pET28a载体，形成pET28a-TpbA载体，携带6×His标签。

1.2.3 基因工程原核表达及纯化：通过IPTG原核诱导表达后，采用针对His标签的预装1mL GE亲和层析柱纯化目的蛋白。

1.2.4 过表达TpbA的鲍曼不动杆菌的制备：采用CaCl2法将上述成功构建的重组质粒pET28a-TpbA以浓度为0.1 ng/mL或10 ng/mL分别转入鲍曼不动杆菌ATCC17978，经western blot和生物活性实验鉴定TpbA过表达情况。

1.2.5 western blot：SDS-PAGE电泳后经转PVDF膜，采用小鼠抗-TpbA的单克隆抗体(BD公司)1∶1 000稀释4 ℃孵育过夜。采用TBST洗三遍后，随后采用HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体室温孵育1h。随后经ECL化学发光法检测特异性条带。

1.2.6 TpbA生物活性检测：采用酪氨酸磷酸化酶活性试剂盒(Promega公司)检测转入菌中的TpbA酶活性。具体方法为TpbA(10 μg)与试剂盒中50 mM磷酸化肽段在50 μL反应体系37 ℃孵育2 h，随后采用50 μL钼酸盐染料溶液室温30 min终止反应。最后，释放的磷酸盐经光密度(OD)为630 nm进行定量检测(Thermo全波长分光光度仪)。

1.2.7 c-di-GMP水平的检测：配置细菌裂解液(20%乙腈，40%甲醇，40%ddH2O，1 μM cGMP)，加入5.5 mL细菌裂解液(按照1 mL/50 OD的比例)，-80 ℃反复冻融5次，每次20min(直至菌体变白)。离心取上清，用冻干机将上清液冻干。加入100 μL小分子提取液(60%甲醇，40%ddH2O),将沉淀重悬，10 000 g离心5 min，取上清用于质谱分析(UPLC-IM-MS质谱仪)。通过质谱将其打碎成小片段，然后定量测定特异性片段的含量表征c-di-GMP水平，最后通过与c-di-GMP标准品比较，得出样品中的c-di-GMP浓度。

1.2.8 生物膜形成实验：参照文献描述的方法，开展生物膜形成实验，旨在评价过表达TpbA对于ATCC17978菌株生物膜形成的影响。具体步骤：首先在LB琼脂培养板培养过夜ATCC17978菌(包括过表达TpbA)，采用PBS重悬菌液至浊度为OD 600=1。随后20 μL/孔加入到无菌的96孔微量培养板(Thermo公司的Nunc品牌)中，在各孔中加入180 μL LB培养基(含氨苄青霉素)，相应的孔中加入1 mM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，30/37 ℃培养及诱导表达24 h。随后弃上清并用磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)缓慢冲洗后，采用1%结晶紫染30 min，清水冲洗3次，被结晶紫着色的菌通过5%醋酸溶液脱色，最终被着色的只剩下生物膜，通过595 nm处检测吸光值。

2 结果

2.1 成功构建TpbA基因载体并表达目的蛋白:western blot结果表明，经特异性抗体结合后，在23 kD与17 kD之间出现特异条带，该条带的分子量大小与预期一致，提示成功构建原核表达载体pET28a-TpbA并表达目的蛋白，见图1(封二)。

2.2 过表达TpbA能够导致ATCC17978菌株c-di-GMP水平显著降低:将上述TpbA基因载体pET28a-TpbA转化为鲍曼不动杆菌ATCC17978菌株，western blot研究证实该菌中的TpbA蛋白表达量显著增加(P<0.05)，见图2(封二)。ATCC17978菌过表达TpbA的磷酸酶活性显著增加(P<0.05)，见图3(封二)。western blot结果经统计学分析发现，过表达TpbA的ATCC17978菌中生物膜形成相关的第二信使c-di-GMP水平显著降低(P<0.05)，见图4(封二)。

2.3 过表达TpbA对于ATCC17978菌株生物膜形成的影响:开展生物膜形成实验，旨在评价过表达TpbA对于ATCC17978菌株生物膜形成的影响。过表达TpbA的ATCC17978菌的生物膜形成结果见图5(封二)，可见TpbA过表达能够显著减少生物膜的形成(P<0.05)，且呈剂量依赖性。

3 讨论

鲍曼不动杆菌对环境适应能力极强且具有较强的耐药性以及致病基因获得能力，近年来该菌耐药性不断上升，临床出现多重耐药鲍曼不动杆菌、泛耐药鲍曼不动杆菌、全耐药株并呈世界性流行[3]。鲍曼不动杆菌成为全球性临床治疗上的一个重大难题，被世界卫生组织认为是需要新抗菌剂的首要病原微生物[4]。研究证实，临床分离的鲍曼不动杆菌菌株几乎都具有较强的细菌生物膜形成能力，生物膜一旦形成，细菌就具有极强的耐药性和致病性[5-6]。

细菌生物膜(BBF)在病原微生物引起的持续感染中起着重要作用。1978年，被誉为“生物膜研究之父”的J.W.(Bill) Costerton提出了生物膜的基本概念。此后生物膜和疾病之间联系的研究开始展开，有报道指出，人类大约65%的感染与生物膜有关[7]，因此，有关生物膜的研究已经成为当前病原微生物领域的热点之一。BBF是一种微生物聚集群体，是细菌吸附于机体黏膜或植入性生物医学材料表面，由菌体和自身分泌的胞外多糖、脂蛋白、纤维蛋白等组成的具有三维立体结构的膜样物[8]。细菌生物膜的形成是一个复杂有序的动态过程，生长周期一般分为5个阶段，即最初定植阶段、不可逆黏附阶段、生物膜早期形成阶段、发展成熟阶段和解聚再定植阶段。它的主要特点是内部细菌的异质性，即生物膜内不同部位的细菌呈现不同的基因表达模式，发挥不同的功能。在生物膜垂直方向不同层面的细菌RNA含量、呼吸活性和蛋白质合成均不同[9]；由于细菌所处的pH值和氧化还原电位等微环境不同，在遗传学上相同的细菌个体表现出不同的特征，如产生的不同毒素使一些细菌对宿主无危害，而另一些细菌可能对宿主有致命威胁[10]。与浮游菌相比，生物膜内细菌显示出更强的耐药性，可以是浮游菌的10～1000倍。尽管生物膜的耐药性是研究的热点领域，但是对于生物膜的顽固耐药性仍然知之甚少。

与其他耐药机制的研究相比，鲍曼不动杆菌生物膜的有关研究起步相对滞后。有研究表明，该菌可在48 h内就形成成熟的生物膜[11]，使得该菌可长期存在于医院环境，如医护人员的指尖、塑料、PVC、陶瓷、橡胶和不锈钢等材料的表面[12]，从而导致机体反复感染，最终导致耐药的发生[13]。生物膜的存在也使细菌能长时间抵抗干燥剂和消毒剂，造成各种与医疗相关感染的暴发[14]。目前关于鲍曼不动杆菌中c-di-GMP影响哪些生物膜基质成分编码基因的表达，以及c-di-GMP调控这些基因表达的机理尚不清楚。对c-di-GMP相关调控机制研究的缺乏，极大地限制了选择防治鲍曼不动杆菌的合理策略和途径，不利于我们利用有限的资源。要加快研究新的作用靶点、开发新型抗菌药物、解决细菌耐药、控制院内感染播散的新途径。

而鲍曼不动杆菌生物膜形成的关键是广泛存在于细菌中的一种核酸类第二信使c-di-GMP，其浓度水平主要是由具有合成活性的DGC和降解活性的PDE控制的。而TpbA是铜绿假单胞菌中c-di-GMP新发现的一种PDE，更重要的是TpbA在鲍曼不动杆菌中存在高度保守基因序列[10]。但是，在鲍曼不动杆菌中，TpbA是否能够通过调控c-di-GMP发挥抑制生物膜的形成尚不清楚。为此，本研究首先构建了TpbA的原核表达载体，确认了TpbA的高效表达。随后，通过转入TpbA载体实现了鲍曼不动杆菌中的高表达，并且证实具有生物学活性。进一步检测发现了c-di-GMP显著减少，这表明了TpbA对于生物膜形成关键第二信使的抑制作用。通过生物膜形成实验，发现过表达TpbA的ATCC17978菌在TpbA显著增加、c-di-GMP显著减少的情况下，生物膜的形成受到显著抑制，提示TpbA可能是通过调控c-di-GMP抑制生物膜的形成，打破鲍曼不动杆菌耐药，表明TpbA具有抗鲍曼不动杆菌感染的潜在应用价值。已有研究表明，TpbA有望成为临床抑制绿脓杆菌生物膜形成及持续感染的有效手段[15]，本研究结果扩充了TpbA的应用范围。

本研究中，TpbA调节鲍曼不动杆菌c-di-GMP影响哪些生物膜基质成分编码基因的表达，以及c-di-GMP调控这些基因表达的机理尚不清楚，需要后续进一步展开研究。现有研究结果表明，c-di- GMP可以从多条途径调节细菌生物膜形成：①通过降低细胞运动性增加细菌对生物和非生物介质的附着能力；②促进某些细菌EPS的产生。细菌生物膜形成的第二步是细菌在初步黏附的基础上，不断堆积生长，直至形成成熟的生物膜。在这一步EPS发挥了重要作用，例如，耶尔森氏鼠疫杆菌反应调节子HmsT和HmsP分别具有DGC和PDE活性，可通过改变胞内c-di-GMP水平调控糖基转移酶HmsR活性，影响EPS的产生和生物膜的形成[16]。有趣的是，作为胞内第二信使的c-di-GMP，在胞外可以抑制金黄色葡萄球菌聚集从而抑制了细菌生物膜的形成，与其胞内作用截然相反[17]。

细菌生物膜形成是细菌产生抗生素耐药和逃避机体免疫系统攻击的主要原因。而生物膜的形成与发挥作用是一个复杂的过程，涉及生物膜内部极其复杂的环境，包括细菌的生存状态、营养状态和机能状态[18]。本研究针对生物膜形成的关键第二信使c-di-GMP展开其关键酶TpbA的调控研究，试图为打破生物膜形成、抗生素耐药提供新的线索与靶点。