宁神安脏饮对失眠大鼠模型行为学和下丘脑GABA及GLU表达的影响

刘 丽，左艳丽，李占涛，蒋敏之，王晓丽，周 斌，张佳雪，何生存

失眠症是临床上最为常见的一种睡眠障碍，成人发病率高达10%～15%，其中有半数以上失眠患者病程可长达10年以上[1]。失眠会严重损害患者的身心健康，对其正常的工作和生活会有不良影响[2-3]。在失眠患者中，肝郁型失眠占很大比例，疏肝安神法成为治疗失眠的常用方法[4-5]。宁神安脏饮是贾孟辉教授临床治疗失眠症的经验方，该药方由柴胡、黄芩、黄连、酸枣仁、郁金等14味中药构成，具有宁神清心，调和肝脾之功效，在临床上运用多年，且疗效显著。近年来有研究表明，宁神安脏饮对顽固性失眠患者有延长患者睡眠时间，提高睡眠质量的作用[6]。但目前对于此方治疗失眠症的具体作用机制尚不明确。本研究采用多因素复合法制备肝郁脾虚型失眠模型，通过观察宁神安脏饮对模型大鼠行为学和下丘脑γ-氨基丁酸(GABA)及谷氨酸(GLU)含量的变化，探讨宁神安脏饮对肝郁脾虚型失眠的改善作用及机制，以期为中医药防治失眠提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料：80只SPF级SD大鼠，雌雄兼用，体质量180～210 g，由宁夏医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(宁)2020-0001。动物饲养在宁夏医科大学实验动物中心，标准饲料喂养，室温(26±1)℃，湿度(50±10)%，可自由饮水摄食。适应性饲养1周后随机分为正常组、模型组、艾司唑仑组、宁神安脏饮组共4组，每组20只。

1.2 药物：宁神安脏饮。组成及用量为(按成人60 kg体质量计算)柴胡15 g、黄芩9 g、黄连9 g、生龙骨25 g、生牡蛎25 g、党参15 g、茯神15 g、磁石30 g、白芍15 g、白术15 g、醋香附15 g、当归15 g、郁金10 g、夜交藤30 g、炒酸枣仁30 g，诸药均先经蒸馏水浸泡40 min，生龙骨、生牡蛎、磁石先煎1 h，后纳入其余诸药，煎煮两次(45 min/次)，期间将两次药液纱布过滤，合并，水浴加热浓缩至含生药量为2.28 g/mL浓度的药液，贮存于4 ℃冰箱内备用，临用前置于20 ℃环境下预热，以上药物均由宁夏医科大学第二附属医院药剂科提供并鉴定，符合《中华人民共和国药典(一部)》[7]标准。艾司唑仑片(生产批号2360712，山东信谊制药有限公司，1 mg/片)。

1.3 失眠大鼠模型的建立和给药：采用大鼠夹尾刺激+饮食失联+PCPA腹腔注射复合因素造模法[8-12]，器械刺激，分别用止血钳轻夹大鼠尾部，致使大鼠激惹相互打斗，45 min/d，打斗以不破皮流血为宜，同时隔日喂食(隔日禁食，隔日足量给食)，持续20 d，于造模第16天起，对模型组及各给药组的大鼠给予对氯苯丙氨酸(D-4-Chlorophenylalanine，PCPA)(Sigma，美国)，PCPA按300 mg/kg溶于弱碱性生理盐水中，配置成混悬液，以10 mL/(kg·d)腹腔注射，连续2 d，大鼠昼夜活动不停，睡眠减少直至消失，神疲乏力、纳少便溏表示造模成功。正常组以生理盐水替代PCPA进行腹腔注射。如果大鼠白天夜晚活动不停，而对照组昼夜节律正常，表明模型复制成功。所有大鼠在实验室适应性饲养1周后灌胃给药，根据人和动物按体表面积折算的等效剂量，宁神安脏饮组大鼠按每次2.28 g/kg给药，艾司唑仑组大鼠每次按剂量0.18 mg/kg给药，均每日2次，连续给药7 d；正常组及模型组给予等体积生理盐水灌胃[13-14]。

1.4 指标检测

1.4.1 一般状态：于实验第0、7、14、21天观察大鼠的精神活动状态、睡眠、皮毛光泽度、饮食饮水量、体重变化及对外界刺激的反应等。

1.4.2 糖水偏好实验:实验开始前，对大鼠进行适应性糖水训练。各组大鼠实验前禁水24 h，第21天上午9：00在鼠笼中放置外观一致、体积相同的水瓶，1瓶纯净水，1瓶2%蔗糖水溶液(先检查饮水瓶是否滴水)。1 h后测量各组大鼠的水消耗量，糖水偏好率(%)=糖水消耗量(mL)/糖水消耗量+纯净水消耗量(mL)×100%。

1.4.3 旷场实验:自制场地规格为长×宽×高=120 cm×90 cm×50 cm的旷场反应箱，箱底及四周均为黑色不能透光，在安静、光强度温和的房间内，连续给药7 d 后，将各组大鼠分别缓慢放入旷场反应箱中央，使用鼠博士分析系统分析各组大鼠5 min内的总活动距离、中央格停留时间、直立次数、修饰次数。每只大鼠测试完毕后，及时清理旷场箱底和侧壁的排泄物以防止前面大鼠残留的气味及排泄物干扰后面的实验结果。

1.4.4 Morris水迷宫实验:水迷宫为直径×高=170 cm×50 cm圆形水池，池内水温控制在24 ℃左右，内设直径×高=10 cm×25 cm逃逸平台，实验过程中保持环境安静，连续给药7 d后，将各组大鼠面壁以第二象限标记处固定位置逐一放入水中，每日进行游泳训练1 min内找到逃逸平台，训练成功后，在造模前后连续测试3 d，第4天撤除逃逸平台正式测试，记录1 min内大鼠从水面自由爬上平台所需时间，即逃避潜伏期，并且记录大鼠的错误次数。每只大鼠测试完毕后，及时清理排泄物以防止前面大鼠残留的气味及排泄物干扰后面的实验结果。

1.4.5 透射电镜观察大脑下丘脑:连续给药7 d，最后一次给药第7 d前禁食12 h，观察给药后各组大鼠的自主活动，于灌胃后60 min用10%水合氯醛按0.3 g/kg剂量进行腹腔注射后，在冰上迅速取出各组大鼠的下丘脑组织，常规透射电镜样品制备(锇酸固定2 h，0.1 mmol PBS漂洗，50%、70%、80%、90%、100%乙醇逐级脱水，纯丙酮置换，Epon812包埋，60 ℃聚合48 h，超薄切片经铀-铅双染)，使用透射电镜观察下丘脑组织神经元超微结构变化。

1.4.6 免疫组化染色:取含下丘脑的组织块进行石蜡切片常规脱蜡至水化，用胰酶修复液(37 ℃)修复20 min，0.01M PBS缓冲液漂洗3次，每次5 min；用3%过氧化氢(消除内源性过氧化物酶)，室温(20 ℃)处理10 min，0.01M PBS缓冲液漂洗3次，每次5 min；0.3%Triton×100室温(20 ℃)孵育10 min，0.01M PBS缓冲液漂洗3次，每次5 min；将载玻片放入湿盒，滴加正常山羊血清封闭液，室温(20 ℃)放置30 min，1 h，不洗；倾去血清，按1∶50滴加γ-氨基丁酸(GABA)多克隆抗体(批号：KGP22222，购自中国南京凯基生物科技发展有限公司)，4 ℃孵育过夜后，0.01MPBS缓冲液洗涤3次/5 min(用振荡器摇晃清洗)；滴加兔抗大鼠IgG(批号KGAA35，购自中国南京凯基生物科技发展有限公司)，室温(20 ℃)孵育30 min，0.01MPBS缓冲液洗涤3次/ 5 min；滴加SABC，室温(20 ℃)孵育30 min，0.01MPBS缓冲液洗涤3次。室温下用新鲜配制的DAB显色液显色5～10 min，镜下控制反应时间，以GABA阳性神经元呈棕黄色、背景为淡黄色为度，自来水充分水洗，蒸馏水洗5～10 s，苏木素复染；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性塑胶封片后显微镜观察各组大鼠下丘脑组织切片，每组随机取3张切片，每张切片在400倍视野下随机选取不重叠的5个视野，图像输入计算机，采用彩色图像分析系统，分别计GABA染色阳性细胞数，取均数。检测谷氨酸(GLU)的步骤同上(GLU多克隆抗体购自中国南京凯基生物科技发展有限公司)。

2 结果

2.1 宁神安脏饮对失眠大鼠模型一般状态的影响：实验开始前各组大鼠精神状态良好，反应灵敏、毛色有光泽。实验结束时，正常组大鼠的精神状态良，反应迅速，毛色有光泽，进食进水正常，二便正常。模型组大鼠精神状态差，毛色干枯无光泽，反应迟钝，进食进水不积极，活动明显减少，喜倚靠鼠笼角落，甚至小便失禁，大便稀薄不成形，形体瘦弱，表现出“肝郁脾虚证”的特点；宁神安脏饮组和艾司唑仑组在精神状态、毛发、体重、饮食饮水、二便等方面均较模型组有改善，表现为精神状态较好，反应尚可，毛发整洁，进食进水较正常，大便可成形等。

2.2 宁神安脏饮对失眠大鼠模型不同时间体重的影响：与正常组大鼠体重相比，模型组和宁神安脏饮组、艾司唑仑组大鼠在造模1周后，体重增长缓慢(P<0.05)。与同时间点模型组大鼠体重相比，宁神安脏饮组和艾司唑仑组大鼠在造模2周、给药1周后，体重相对增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与同时间点模型组大鼠体重相比，宁神安脏饮组和艾司唑仑组大鼠在造模3周、给药2周后，体重明显增加(P<0.05)，见表1。

表1 宁神安脏饮对失眠大鼠模型不同时间体重的影响

2.3 宁神安脏饮对失眠大鼠模型糖水偏好率的影响：与正常组影响，模型组大鼠糖水消耗量和糖水偏好率均降低(P<0.05)；与模型组比较，宁神安脏饮组、艾司唑仑组大鼠的糖水消耗量和糖水偏好率均增加(P<0.05)，见表2。

表2 宁神安脏饮对失眠大鼠模型糖水偏好率的影响

2.4 宁神安脏饮对失眠大鼠模型旷场实验结果的影响：与正常组比较，模型组的总活动距离、中央格停留时间、直立次数、修饰次数均低于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，宁神安脏饮组、艾司唑仑组的总活动距离、中央格停留时间、直立次数、修饰次数均增加(P<0.05)，见表3。

表3 宁神安脏饮对失眠大鼠模型旷场实验结果的影响

2.5 宁神安脏饮对失眠大鼠跳台实验结果的影响：与正常组比较，模型组的平均逃避潜伏期显著延长(P<0.05)，错误次数明显增加(P<0.05) ；与模型组比较，宁神安脏饮组和艾司唑仑组能明显缩短逃避潜伏期(P<0.05)，减少错误次数(P<0.05)，见表4。

表4 宁神安脏饮对失眠大鼠跳台实验结果的影响

2.6 宁神安脏饮对失眠各组大鼠模型脑组织细胞超微结构的影响：正常组脑细胞形状规则，胞质内线粒体丰富，呈圆形或棒槌形，内嵴排列整齐、清晰，粗面内质网散在分布，表面有密集的核糖体附着，胞核形状规则，核膜完整，核孔清晰可见，染色质分布均匀，细胞器结构完好。模型组脑细胞线粒体、内质网水肿，部分结构破坏，染色质浓集、边聚、胞浆浓缩。宁神安脏饮组脑细胞超微结构损伤明显减轻，水肿明显减轻，偶见局部膜崩解。艾司唑仑组脑细胞细胞核稍有固缩，基质固密，无空泡，见图1(目录后)。

2.7 宁神安脏饮对失眠大鼠模型下丘脑GABA及GLU表达的影响：显微镜下胞浆或胞核有棕色颗粒者为阳性细胞。与正常组比较，模型组的GABA及GLU阳性细胞数明显增多，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，宁神安脏饮组和艾司唑仑组的GABA及GLU的阳性细胞数明显降低(P<0.05)，见表5，图2至图3(目录后)。

表5 宁神安脏饮对失眠大鼠模型下丘脑GABA及GLU表达的影响

3 讨论

宁神安脏饮全方共奏轻清与重降并用、温凉与补泻兼施之义。有研究表明顽固性失眠多为气郁体质，而气郁日久易化火伤肝体、耗肝血。脾气实则五脏安和、神智宁谧[15]。思虑过度则损伤脾胃，且胃不和则卧不安，故治疗顽固性失眠在宁神清心的基础上，兼顾调和肝脾。组方中柴胡味苦微寒，为半表半里和解之药，能升发肝胆之气，肝胆在调节人体阴阳气血的正常运转中起到轴枢的作用[16]，可枢转气机，疏肝解郁，使清气上行，阴气下降；黄芩药性苦寒，能清中、上二焦之郁火，和解枢机不利之郁热。柴胡与黄芩相配，一清一散，一升一降，以清散郁火、清心宁神；黄连味苦微寒，主降心火，与黄芩相配，能清上、中、下三焦之郁火；生龙骨、生牡蛎、磁石为重镇安神药，可引阳破阴，使阴阳相交，神明安矣；半夏辛温，与黄芩相配可辛开苦降，调达中焦气机；党参性味甘平，有补五脏，安精神，定魂魄之功[6]；白术味甘味苦，可健脾益气；酌加生地、当归养血安神，炒酸枣仁、郁金、夜交藤解郁安神，全方共奏宁神清心、调和肝脾之效。

正常大鼠经夹尾刺激+饮食失联+PCPA多因素干预后，正常的睡眠-觉醒周期遭到破坏，出现焦虑、烦躁等不良情绪，这与以往实验研究失眠大鼠建模结果一致[17]。模型组的大鼠出现精神状态差，反应迟钝，喜倚靠鼠笼角落，活动减少，毛色干枯无光泽，进食进水不积极，体重增加缓慢，甚至小便失禁，大便稀薄不成形，加之饮食不节，脾胃失调，表现出肝郁脾虚证的特点。研究表明，宁神安脏饮能够改善失眠症大鼠的精神状态及睡眠时间，增加失眠症大鼠的体重及糖水消耗量。

此外，旷场实验是研究大鼠情绪反应的常用方法，可反应动物探索学习、恐惧警觉等行为特征，其中总活动距离反映大鼠的探究能力和兴奋性，中央格停留时间反应大鼠的趋避性、焦虑或抑郁心理以及认知功能状态，直立次数和修饰次数反映大鼠的空间认知和警觉性[18-20]。与模型组比较，宁神安脏饮组大鼠的总活动距离、中央格停留时间、直立次数、修饰次数均增高，故推断出宁神安脏饮可改善失眠症大鼠自主探究行为、精神意志运动迟钝等行为学表现。水迷宫实验是测试空间学习和记忆的常用方法[21]，与模型组比较，宁神安脏饮组能明显缩短模型组大鼠的逃避潜伏期，减少错误次数，故推断宁神安脏饮可提高失眠症大鼠空间学习记忆能力。

本研究通过透射电镜观察到宁神安脏饮能够改善失眠症大鼠下丘脑组织细胞超微结构形态。下丘脑是公认的“觉醒中枢”和“睡眠中枢”，多种神经递质如γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸(GLU)等通过中枢对睡眠发挥了关键的调节作用[22]。其中，GABA是一种抑制性神经递质，广泛存在于中枢神经系统中[23]，GABA在大脑组织中的含量与睡眠-觉醒的深度呈正相关[24]；实验表明，与正常组比较，模型组较正常组GABA和GLU的含量降低(P<0.05)；与模型组比较，宁神安脏饮组GABA和GLU的含量均相对升高(P<0.05)，提示宁神安脏饮对大鼠脑内神经氨基酸类递质含量的调解作用显著，并可以改善失眠状况。

综上所述，宁神安脏饮可明显改善肝郁脾虚型大鼠的行为学，激发大鼠自发活动能力和探究能力，其作用机制可能与调节失眠大鼠下丘脑GABA和GLU的含量，进而平衡中枢神经系统功能有关。本研究为临床推广使用宁神安脏饮治疗失眠提供了参考。